Флуоресцентные репортеры и их репортажи

Е.О. Пучков

Как известно, однажды свет был успешно отделен от тьмы. С тем, что такое тьма, еще предстоит разобраться: пока наметились лишь некоторые перспективы в связи с изучением темной материи и темной энергии. А вот свет человечество давно изучает и использует, в том числе и как исследовательский инструмент.

В последние тридцать лет стремительно растет число методов исследования, основанных на регистрации флуоресценции, и они все шире применяются в биологии и медицине. Обусловлено это как развитием техники, в первую очередь компьютеров и лазеров, так и появлением широкого спектра доступных флуоресцирующих молекул и молекулярных комплексов, так называемых флуоресцентных репортеров. Флуоресцентная методология благодаря высокой чувствительности и сравнительной безопасности вытеснила многие традиционные методы, связанные с применением радиоактивных веществ. Методы флуоресцентного анализа используются как в фундаментальных исследованиях для получения новых знаний о живом, так ив прикладных работах — в биотехнологии, медицинской диагностике, криминалистике... Что же представляют собой флуоресцентные репортеры? Какую информацию из глубин микромира можно получить с их помощью? Как эту информацию регистрируют и анализируют? Но прежде всего — что такое флуоресценция?

Флуоресценция: свечение, индуцированное светом

Некоторые вещества после поглощения света в определенном диапазоне длин волн начинают излучать свет в другом, более длинноволновом диапазоне. Давно было замечено, что растворы некоторых органических соединений и минералов изменяют цвет, если наблюдать их не на просвет, а под углом к проходящему свету. Так, например, шотландский натуралист Дэвид Брюстер в 1833 году заметил, что от зеленого спиртового раствора хлорофилла при освещении белым светом «отражается» красный свет. Позднее, в 1845 году, знаменитый астроном и физик Джон Гершель описал появление голубой окраски у бесцветного раствора сульфата хинина при облучении солнечным светом. В 1852 году математик и физик Джордж Стокс обнаружил видимое глазом свечение минерала флуорита при его облучении невидимым ультрафиолетовым излучением. «В честь» флуорита он назвал это явление флуоресценцией, по аналогии с термином «опалесценция», описывающим явление дихроизма в опале. (Опалесценция — это разновидность дихроизма: рассеяние света, которое иногда сопровождается интерференцией. Хотя опалы тоже выглядят желтоватыми в проходящем свете и голубоватыми — в рассеянном, перпендикулярном к проходящему, это не флуоресценция.)

Флуоресценция — один из видов люминесценции. Этим термином описывают все виды излучения, вызванного возбуждением молекул различными факторами. Так, например, в некоторых химических реакциях возникает хемилюминесценция. Хемилюминесценцию в биологических объектах называют биолюминесценцией. Есть вещества, которые испускают свет при возбуждении электрическим током (электролюминесценция), быстрыми электронами (катодолюминесценция), γ-излучением (радиолюминесценция) и другие. В этом контексте флуоресценция относится к категории фотолюминесценции.

Способные флуоресцировать атомы, молекулы и молекулярные комплексы называют флуорофорами, или флуорохромами. Иногда флуорохромами называют все виды флуоресцирующих молекул, а флуорофорами — только флуоресцирующие компоненты (группировки) крупной молекулы. Однако дальше мы будем использовать термин «флуорофор» для всех типов флуоресцирующих веществ. Отметим также, что в исследовательской практике ковалентно присоединенный к макромолекуле флуоресцирующий компонент принято называть флуоресцентной меткой, а свободный флуорофор — зондом. Применяемые в микроскопии флуорофоры традиционно именуют флуоресцентными красителями. Наконец, флуорофоры, используемые в биологических исследованиях, некоторые авторы стали называть биосенсорами.Физическую природу флуоресценции удобно проиллюстрировать, пользуясь диаграммой, которую предложил польский физик Александр Яблонский в 1933 году и которая носит его имя (рис. 1).


Диаграмма Яблонского

pic_2014_09_08.jpg
1. Горизонтальные линии — энергетические уровни электронов: S0 — основное, невозбужденное состояние; S1 — синглетное возбужденное состояние; 0–3 — квантованные подуровни; Т12 — квантованные уровни триплетного возбужденного состояния. Стрелками показаны переходы электронов в разные энергетические состояния

При поглощении фотонов определенной энергии в молекуле флуорофора происходит переход электронов из основного (S0) на один из подуровней возбужденного (S1,S2, … Sn) состояния с более высокой энергией. Спин электрона при переходе не меняется, поэтому данные уровни называют синглетными. Возбужденное состояние нестабильно, и электроны быстро возвращаются на исходный энергетический уровень. Происходить это может несколькими путями. Три из них — безызлучательные квантовые переходы: внутренняя конверсия (уменьшение энергии электрона до минимального синглетного уровня), интеркомбинационная конверсия (уменьшение энергии электронов с изменением спина, с переходом на так называемый триплетный уровень) и вибрационная релаксация (рассеяние поглощенной энергии в виде тепла). Два других сопровождаются излучением света — это флуоресценция и фосфоресценция. Флуоресценция возникает при переходе в основное состояние с нижнего синглетного уровня, а фосфоресценция — с триплетного.


Отметим три важных обстоятельства. Во-первых, вероятности переходов, показанных на рис. 1, различаются. О вероятности можно судить по времени, за которое осуществляется каждый из переходов, или по времени пребывания электронов в каждом из этих состояний (см. таблицу): чем меньше время, тем более вероятен данный переход. Очевидно, что флуоресценция и тем более фосфоресценция — маловероятные процессы. Вот почему большинство флуорофоров светятся слабо даже при интенсивном облучении. Во-вторых, поскольку флуоресценция возможна при переходе электронов в основное состояние только с самого низкого синглетного уровня, энергия излучения меньше поглощенной энергии. Поэтому спектр флуоресценции флуорофора всегда находится в более длинноволновой области по сравнению со спектром поглощения. И наконец, в-третьих, состояние электронов, участвующих в процессах, зависит как от физических факторов окружающей среды, так и от общей электронной конфигурации молекулы. Именно это обстоятельство и делает флуорохром молекулярным репортером, который на языке флуоресценции сообщает о физико-химических условиях своего окружения. Молекулярный репортер, в отличие от газетного репортёра, произносится с ударением на второй слог. Но задачи перед ними стоят сходные: проникнуть туда, куда поручили, и отправить репортаж с места событий.

pic_2014_09_09-3.jpg
Времена потенциальных переходов электронов между разными энергетическими состояниями в флуорофорах

Язык флуоресцентных репортеров

Итак, параметры флуоресценции — язык, с помощью которого флуоресцентный репортер передает информацию. Если продолжить аналогию, то параметры подобно словам приобретают смысл только в контексте, иначе говоря, с учетом условий регистрации. У каждого флуорофора имеется пять ключевых характеристик: спектры поглощения и флуоресценции, а также квантовый выход, время жизни и анизотропия флуоресценции.

pic_2014_09_09-1.jpg
2. Спектры поглощения (пунктир) и флуоресценции (сплошные линии) флуоресцеина и вещества с коммерческим названием Lyso Tracker Blue («Molecular Probes»)
Изображение: ww.lifetechnologies.com

Спектры поглощения и флуоресценции показывают, свет с какими длинами волн преимущественно поглощает и излучает данное вещество (рис. 2). Основные параметры спектра интенсивность флуоресценции, положение максимума и так называемая полуширина (ширина спектра на уровне половины максимума). Можно считать, что максимум спектра флуоресценции — это ее цвет, например, если максимум около 540 нм, это означает, что свечение в данных условиях будет зеленым. Оговорка про условия не случайна. Часто именно эти параметры информируют наблюдателя о свойствах окружения, в котором находится репортер. Так, в спектре флуоресценции многих флуорохромов возникают характерные изменения при сдвиге рН среды. Если такие изменения могут быть вызваны только изменениями кислотности и ничем иным, то флуорофор ожет быть своего рода молекулярным рН-метром — рН-репортером. Характерный пример — Lyso Sensor™ Yellow/Blue, чьи спектры показаны на рис. 3.

pic_2014_09_09-2.jpg
3. Спектры флуоресценции Lyso Sensor Yellow/Blue («Molecular Probes») при рН 3 и 9. При изменении кислотности среды меняются и максимум флуоресценции, и общая форма спектра
Изображение: ww.lifetechnologies.com

Квантовый выход флуоресценции — это характеристика эффективности, с которой поглощенная энергия трансформируется в излучение по сравнению с процессами безызлучательной релаксации. Количественно он определяется как отношение числа высвеченных фотонов к числу поглощенных. Чем больше квантовый выход, тем больше интенсивность свечения флуорофора. Флуоресцентный репортер часто выбирают именно по этому показателю. Например, флуоресцеин с квантовым выходом около 0,9 (почти единица!) широко применяют как в роли самостоятельного зонда, так ив качестве флуоресцентной метки нефлуоресцирующих молекул. Важно также и то, что этот показатель очень чувствителен к физико-химическим взаимодействиям репортера.

Время жизни флуоресценции — усредненное время, в течение которого молекулы флуорофоров находятся в возбужденном состоянии перед испусканием фотонов. Измеряют этот показатель по затуханию флуоресценции после кратковременного возбуждения. Время жизни флуоресценции, с одной стороны, очень чувствительно к физико-химической «обстановке», в которой находится репортер. С другой стороны, у каждого флуорофора это время свое, что позволяет получать репортажи из одного образца от флуоресцирующих молекул с похожими спектральными характеристиками. Приходя в разное время, сигналы не перекрываются.

Наконец, анизотропия флуоресценции — количественная характеристика зависимости поляризации флуоресценции от поляризации возбуждающего света. По анизотропии можно судить о вращательной подвижности репортера и тем самым о вязкости среды в его микроокружении.

Но информационные возможности флуоресцентных репортеров этим не ограничиваются. Так, например, существует явление безызлучательной, или резонансной, передачи энергии (БПЭ) от одного флуорофора на другой. При этом интенсивность флуоресценции у донора энергии уменьшается, ау акцептора возрастает. Передача возможна между флуорофорами с определенными спектральными свойствами — и, что особенно важно, находящимися на достаточно близком расстоянии. Это позволяет выявлять взаимодействие молекул и даже оценивать расстояние между ними. Вот почему БПЭ иногда называют «молекулярной линейкой».

Интересные возможности исследователям предоставляет тушение флуоресценции при физическом взаимодействии флуорофора с молекулами-тушителями, такими, как кислород, галогены, амины, некоторые электрондефицитные органические молекулы. В этом случае флуоресцентный репортер сообщает о присутствии в его окружении определенных тушителей.

Тушение флуорофора может происходить также за счет фотообесцвечивания под влиянием излучения большой интенсивности. Обычно это явление мешает экспериментатору, но в умелых руках может стать специальным методическим приемом. Так, наблюдение за восстановлением флуоресценции флуорофора после фотообесцвечивания дает информацию о вязкости и диффузионных свойств цитоплазмы. В небольшом участке клетки, содержащей флуорофор, его обесцвечивают кратковременной мощной вспышкой лазера, а затем наблюдают, как флуоресценция восстанавливается за счет диффузии необесцвеченных молекул из других участков клетки.

Какие они, флуоресцентные репортеры?

Условно можно выделить две группы репортеров, созданных на основе органических и неорганических флуорофоров.

Органические флуорофоры наиболее многочисленны и разнообразны. Как велико это разнообразие, можно представить, заглянув в каталог фирмы «Molecular Probes», специализирующейся на разработке и производстве флуорофоров c 1975 года. На момент написания статьи по ссылке было уже одиннадцатое обновление каталога: темпы роста в этой области впечатляют.

У каждого репортера — своя специализация: достоинства и возможности каждого определяют круг задач, для решения которых его применяют. Проиллюстрируем это на примере флуоресцеина и его производных (рис. 4). Как уже отмечалось, этот флуорофор имеет высокий квантовый выход и соответственно яркую флуоресценцию. Он может быть репортером рН, однако для измерения рН внутри клеток он не подходит, так как не проникает через цитоплазматическую мембрану. Зато мембрану может преодолеть его гидрофобное производное — флуоресцеиндиацетат. Правда, ацетильные группы лишают его возможности флуоресцировать, но внутри клетки их отщепляют ферменты эстеразы. Аналогичным образом (в форме диацетата) доставляется в клетки дихлорфлуоресцеин, который служит для регистрации в клетках активных форм кислорода. Если присоединить к молекуле флуоресцеина изотиоцианатную группу, такой флуорохром будет связываться с аминогруппами нефлуоресцирующих молекул. Таким образом делают флуоресцирующие антитела, стрептавидин (реагент на биотин), а также нуклеотиды и олигонуклеотиды. Наконец, 5-карбоксиметокси-2-нитробензиловый эфир флуоресцеина (не показан на рис. 4) сам не флуоресцирует, но превращается в обычный флуоресцеин при облучении светом с длиной волны 355 нм.

pic_2014_09_10.jpg
4. Структурные формулы флуоресцеина и некоторых его производных

В 70-х годах ХХ века при изучении биолюминесценции медузы Aequorea victoria были выделены два белка, участвующих в этом процессе. Они всем известны с тех пор, как Нобелевскую премию по химии 2008 года получили их открыватели и создатели исследовательских инструментов на их основе — Осаму Шимомура, Мартин Челфи и Роджер Тсиен (см. «Химию и жизнь» 2008 №12), Один из этих белков, экворин, в присутствии ионов кальция окисляет свою простетическую группу, причем возникает хемилюминесценция голубого цвета; второй белок поглощает голубой свет и флуоресцирует зеленым.

Этому второму белку, названному просто green fluorescent protein (зеленый флуоресцентный белок — GFP, или ЗФБ), суждена была громкая слава. После открытия GFP начались интенсивные исследования его структуры, был клонирован его ген. Оказалось, что этот ген сравнительно несложно экспрессировать в клетках других организмов. Можно также соединить его с геном другого белка и внедрить этот гибридный ген в клетку — тогда она начнет синтезировать белок с флуоресцентной меткой. Позднее у некоторых морских беспозвоночных (кораллов и полипов) обнаружили аналогичные белки с другими спектрами флуоресценции. Методы молекулярной биологии позволили сконструировать гены, кодирующие модифицированные формы флуоресцентных белков с широким диапазоном спектральных характеристик, а также фоторегулируемые варианты, свечение которых можно включать и выключать с помощью ультрафиолетового излучения. Сегодня к услугам исследователей на основе GFP созданы флуоресцентные белки всех цветов радуги, с самыми разнообразными свойствами, и постоянно появляются новые.

Несколько скромнее пока выглядит судьба экворина. Изучение зависимости его хемилюминесценции от ионов кальция позволило разработать методики измерения концентрации Ca2+ в некоторых клетках. Для этого существуют и флуоресцентные репортеры, однако хемилюминесцентный метод с использованием экворина не требует облучения, возбуждающего флуоресценцию, которое не всегда безвредно для биологической системы. Экворин относят к сравнительно большой группе люциферинов — веществ, ответственных за био(хеми)люминесценцию у некоторых морских и наземных организмов. Они интересны не только с точки зрения их практического применения: ведь до сих пор идут споры о том, зачем биологическим объектам вообще нужна биолюминесценция.

Неорганические флуорофоры чаще всего используют в составе так называемых биоконъюгатов — комплексов с органическими соединениями или биомолекулами. Многие атомы, например, переходные металлы, лантаниды (точнее, их ионы, например Tb3+ и Eu3), кластеры из нескольких атомов золота и серебра, в составе таких комплексов приобретают способность к сенсибилизированной флуоресценции. Энергия света, поглощенного органическим соединением, передается на атом неорганического элемента, который и излучает флуоресценцию. Важно то, что молекулы — доноры энергии передают ее от электронов, находящихся в триплетном состоянии. Поэтому излучение неорганических флуорофоров в таком комплексе замедленно по сравнению с обычной флуоресценцией, поскольку время жизни электронов в триплетном состоянии заметно больше, чем в синглетном (см. таблицу). Кроме того, спектры флуоресценции неорганических биоконъюгатов имеют небольшую ширину и сильно сдвинуты относительно спектров поглощения. Благодаря этому неорганические биоконъюгаты можно использовать и тогда, когда в исследуемой системе присутствуют другие компоненты, флуоресцирующие в том же диапазоне длин волн.

Особое место в этой группе занимают репортеры-биоконъюгаты, в которых в качестве флуорофора используются полупроводниковые кристаллы размером 2–10 нм (нанокристаллы), получившие название квантовых точек — quantum dots. Как правило, они состоят из пары элементов III/V (например, CdS, CdSe, ZnS) или II/VI групп (например, GaN, InP, InAs). Из-за малых размеров полупроводниковых кристаллов (в них всего по 10–50 атомов!) для электронов создаются условия квантованных энергетических переходов, подобных тем, что существуют в отдельных атомах. (Квантовые точки иногда даже называют «искусственными атомами».) При этом энергия переходов, а тем самым и длина волны флуоресценции зависят от размера кристалла. Чем меньше кристалл, тем больше энергия излучения, то есть меньше длина волны флуоресценции (см. фото ниже). Это свойство открывает возможность создания квантовых точек практически с любой спектральной конфигурацией. Добавим, что по сравнению с органическими флуорофорами они обладают более высоким квантовым выходом и фотостабильностью. На рис. 5 показаны примерные размеры различных флуорофоров-репортеров.

pic_2014_09_11.jpg
5. Относительные размеры флуоресцентных репортеров. Для сравнения показан также белок иммуноглобулин G (Ig G) — иначе говоря, молекула-антитело

Биоконъюгаты на основе квантовых точек состоят из ядра (например, CdSe), которое покрыто слоем полупроводникового материала (например, ZnS), выполняющим защитную функцию, и лиганда — какого-нибудь органического вещества, обеспечивающего растворимость и/или присоединение биологических молекул. Биоорганическая оболочка обеспечивает стабильность биоконъюгата как коллоидной частицы и формирует задание репортера, его назначение: где и с чем провзаимодействовать, какую собрать и передать информацию. При этом, конечно, размеры репортера на основе квантовой точки могут существенно увеличиться (рис. 5). В биоорганическую оболочку включают и низкомолекулярные соединения, такие, как биотин, и высокомолекулярные — одноцепочечные фрагменты ДНК, белки, в том числе ферменты или антитела (IgG).

pic_2014_09_01-3.jpg
Пример «неживой» флуоресценции — коллоидные растворы квантовых точек разного размера. Квантовые точки — полупроводниковые кристаллы нанометровых размеров. Электроны в них могут совершать квантованные энергетические переходы, причем энергия переходов (а значит, и длина волны флуоресценции, или ее цвет) зависит от размера кристалла.

Как читают флуоресцентные репортажи...

Первым в списке инструментов для получения и анализа сообщений флуоресцентных репортеров был человеческий глаз. Флуоресцентное свечение макроскопических объектов мы наблюдаем непосредственно, а микроскопических — с помощью флуоресцентного (люминесцентного) микроскопа. Примерами макроскопических объектов могут служить колонии микроорганизмов, в которых экспрессированы флуоресцентные белки, или хроматограммы и электрофореграммы с применением флуоресцентных красителей. В обычный флуоресцентный микроскоп (о необычных микроскопах — см. подверстку), как правило, заглядывают для выявления иммунологических реакций с использованием меченных флуорофорами антител, применяют их и в некоторых исследованиях на уровне единичных клеток.

Особо отметим эстетическую информативность этих методов. Флуоресцентные репортеры на микрофотографиях открывают нам чарующий мир разнообразных цветов и форм (см. фото ниже). Фирмы-производители микроскопов «Nikon» и «Olympus» даже проводят ежегодные конкурсы фоторабот о микромире в свете флуоресценции (работы-победители см. на сайтах Nikon Small World и Olympus BioScapes).

В отличие от флуоресцентных микроскопов, проточные цитометры не дают возможности полюбоваться флуоресцирующими объектами. Их сильная сторона — скорость егистрации сигналов от единичных объектов, например от клеток в суспензии. Обычный коммерчески доступный цитометр работает со скоростью 1000 клеток в секунду, а специализированные высокопроизводительные — до 25 000 клеток в секунду! В стандартном варианте у каждого объекта измеряются от двух до десяти параметров: светорассеяния и флуоресценции одного или нескольких флуорофоров. Таким образом можно получить статистически достоверные результаты по гетерогенности клеточных, в частности микробных, популяций. Существуют также приборы, способные сортировать клетки по определенным параметрам светорассеяния или флуоресценции, чтобы затем изучать субпопуляции с использованием других методов.

pic_2014_09_01-2.jpg
Биомолекулы, несущие флуоресцентные метки-репортеры, — это не только информативно, но и красиво. Лучшее тому подтверждение — микрофотографии с галереи ежегодного конкурса Nikon Small World: а — фибробласты мыши, б — веслоногий рачок Temora longicornis; в — митоз в клетках легких тритона; г — клетки глии мозжечка мыши in vivo (двухфотонная флуоресцентная микроскопия).

...И что из них можно узнать

Итак, все флуоресцентные репортеры имеют специализацию, то есть способны избирательно характеризовать определенные свойства биологической системы. Остановимся вкратце на некоторых категориях «специалистов».

С помощью ряда флуоресцентных репортеров (как правило, органических флуорофоров) можно следить за ферментативным катализом — исследовать динамику ферментативных реакций, их локализацию в клетках, тканях, органах и т.п. Это, например, субстраты с ковалентно присоединенными флуорофорами, которые начинают флуоресцировать только после высвобождения в ходе реакции, или «профлуорофоры», становящиеся флуоресцентными при взаимодействии с продуктом реакции.

Репортеры, сформированные на основе антител — физические комплексы или ковалентные соединения флуорофоров с антителами, — информируют о протекании иммунологических реакций. Флуоресцирующим компонентом может быть любой из известных органических и неорганических флуорофоров, включая квантовые точки. Кроме того, к антителам можно присоединять ферменты, катализирующие реакции с образованием флуоресцирующего продукта. Современные технологии позволяют получить антитела к любому белку (антигену), интересующему исследователя, антитело же с флуоресцентной меткой заставит светиться этот белок или структуру, из него построенную. Например, с помощью флуоресцентных антител выявлены микрофибриллы в фибробластах мышей (см. фото выше).

Очень информативны методы с использованием флуоресцентных белков (ФБ). Мы уже упоминали о том, как полезны методы внедрения в клетку генов гибридных белков, которые заставляют флуоресцировать естественный белок или даже нуклеиновую кислоту. Вдобавок флуоресценция ФБ-содержащих гибридных белков зависит от кислотности среды, что позволяет измерять рН не только внутри клетки, но и внутри отдельных органелл, если такой белок «адресован» в ядро или митохондрию.

Особый интерес вызывает применение ФБ в сочетании с методиками измерения флуоресценции, основанными на безызлучательной передаче энергии. Представьте себе два гибридных белка, один из которых заставляет флуоресцировать другой при сближении. Подобным же образом можно изучать конформационные (структурные) изменения в белках, если присоединить ФБ к разным участкам одной белковой молекулы.

Чувствительность флуоресценции к физическим свойствам микроокружения флуорофоров позволяет использовать некоторых из них в качестве репортеров различных параметров внутриклеточной среды. В их числе, например, вязкость цитоплазмы, внутреннего содержимого органелл, гидрофобного слоя биомембран. Взаимодействие некоторых флуорофоров с биологическими мембранами зависит от разности электрических потенциалов на мембране: с помощью таких репортеров получают сведения о величине мембранного потенциала. Существуют даже репортеры для измерения внутриклеточной температуры!

Что высветили в микромире флуоресцентные репортеры

Флуоресцентные репортеры долго и успешно служат во многих, если не во всех областях экспериментальной биологии. Однако есть такие области, где они сыграли ключевую роль.

С использованием флуоресцентных репортеров была экспериментально доказана модель жидкокристаллической структуры всех биологических мембран. Согласно этой модели, при всей ее структурной целостности мембрана достаточно «жидкая», чтобы отдельные ее компоненты могли перемещаться в нужные стороны. Такое представление позволяет понять основные молекулярные механизмы функционирования мембран, а также свойства живых клеток в целом.

В значительной мере благодаря информации от флуоресцентных репортеров прояснились механизмы трансформации энергии в клетках. Особую роль здесь сыграли флуорофоры, позволяющие регистрировать внутриклеточный и внутримитохондриальный рН, а также разность электрических потенциалов на мембранах. С их помощью прежде всего был выявлен механизм сопряжения энергодонорных реакций окисления с энергозатратным синтезом аденозинтрифосфата (АТФ) — универсального поставщика энергии для большинства метаболических процессов. Кроме того, была изучена природа накопления различных веществ в цитоплазме и в клеточных органеллах за счет мембранного электрического потенциала и градиента рН.

Жизнедеятельность клеток обеспечивается совокупностью скоординированных в пространстве и времени биохимических реакций, а за координацию отвечают так называемые сигнальные системы. Основные компоненты этих систем были изолированы и охарактеризованы с помощью методов традиционной биохимии и молекулярной биологии. Однако только подходы, основанные на применении флуоресцентных репортеров, показали напрямую, где пролегают эти пути и как

по ним проходят сигналы, — стало возможным в реальном времени следить за взаимодействиями сигнальных белков или оценивать динамику экспрессии генов в отдельно взятой клетке. С помощью флуоресцентных репортеров удалось обнаружить и неизвестные ранее сигнальные компоненты, например выявить роль ионов Ca+2 как сигнального посредника во многих регуляторных реакциях.

Во второй половине ХХ века в микробиологии возникла проблема, которую окрестили «великой аномалией учета микроорганизмов с помощью чашек Петри». «Виновниками» оказались флуоресцентные репортеры, два красителя нуклеиновых кислот — акридиновый оранжевый и 4,6-диамидино2-фенилиндол. Оценить содержание микроорганизмов в природном образце можно, либо подсчитывая колонии, выросшие на чашке Петри (при достаточном разведении «посевного материала» каждую колонию образуют потомки лишь одной клетки), либо напрямую подсчитывая под микроскопом сами микроорганизмы, прокрашенные флуоресцентными красителями нуклеиновых кислот. Так вот, флуоресцентные репортеры всегда выявляли значительно больше микроорганизмов, чем анализ с чашками Петри.

Для объяснения этого противоречия были выдвинуты две гипотезы. Согласно первой, часть клеток, находящихся в состоянии покоя, не размножается на чашках Петри. Согласно второй, условия культивирования (состав среды, температура и др.) не соответствуют потребностям некоторой части популяции. Проверка этих гипотез показала, что возможно и то, и другое. Более того, был дан толчок к формированию двух новых больших направлений исследований. Первое связано с изучением так называемого жизнеспособного, но некультивируемого состояния микроорганизмов. Понятна практическая значимость таких исследований: например, патогены человека в этом состоянии могут быть невидимы для стандартных методов диагностики и более устойчивы к лекарственным препаратам. Второе направление — выявление и изучение микроорганизмов в природных образцах путем прямого анализа их нуклеиновых кислот, без предварительного получения чистых культур, как это делалось раньше. Это направление получило собственное название — метагеномика. Благодаря методам метагеномики (кстати, некоторые из этих методов предполагают использование флуоресцентных репортеров) появилась возможность по-новому увидеть биологическое разнообразие микроорганизмов в отдельных экосистемах и на Земле в целом.

Итак, современные флуоресцентные репортеры — это огромная армия специалистов, и многие из них уже имеют громкую славу в экспериментальной биологии. Их репортажи позволили лучше разглядеть те уголки микромира, куда может заглянуть свет. Однако многие исследователи, работающие в данной области, считают, что все, увиденное нами в свете флуоресценции до сих пор, — это только начало!

Доктор биологических наук
Е.О. Пучков,
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН


Не только на глаз

pic_2014_09_12.jpg
Конфокальный микроскоп

Возможности зрительного анализа ограничены в основном качественной оценкой: «есть свечение — нет свечения». Гораздо больше информации дают количественные характеристики (см. главу «Язык флуоресцентных репортеров»).

Для количественной характеристики флуоресценции используют две методологии. Первая служит для измерения различных характеристик флуоресценции в сравнительно большой (макроскопической) области объекта, что обеспечивает получение усредненных характеристик по объекту: раствору, суспензии коллоидных частиц, клеток, субклеточных частиц и т.п. Вторая ориентирована на единичные микроскопические объекты, в первую очередь клетки и субклеточные частицы.

Измерения интегральной флуоресценции проводят с помощью спектрофлуориметров (флуоресцентных спектрофотометров) и планшетных флуориметров (англ. plate readers). Спектрофлуориметры — это, как правило, аналитические приборы, на которых можно получить все основные характеристики флуоресценции. Планшетные флуориметры — устройства для анализа большого количества образцов (иногда более тысяч), но лишь по нескольким фиксированным характеристикам, например по интенсивности флуоресценции в определенной спектральной области и/ или по времени жизни флуорофоров в возбужденном состоянии. Большинство методик с использованием планшетных флуориметров основано на иммунологических реакциях или на анализе развития культур клеток в монослоях.

Методология измерений флуоресценции единичных микроскопических объектов также имеет два варианта.

Первый основан на получении цифровых изображений объектов с последующим компьютерным анализом. Второй — на «поштучном» измерении флуоресценции микрообъектов в потоке, при прохождении через узкий капилляр специального прибора — проточного цитометра.

Флуоресцентная микроскопия недавно пережила настоящую революцию: разработаны новые устройства, прежде всего конфокальные микроскопы, в которых возбуждение и регистрация флуоресценции осуществляются через микроскопическое отверстие, отсекающее «лишнее» свечение, которое возникает вне фокуса объектива. Этот «зрачок» сканирует изображение в горизонтальной и/или вертикальной плоскости, сигналы регистрирует фотоумножитель, и после их компьютерной обработки получается пространственное изображение объекта. Такая конструкция позволяет получать более четкие по сравнению со стандартными микроскопами двумерные и трехмерные изображения. Кроме того, на современных конфокальных микроскопах можно проводить измерения параметров затухания флуоресценции.

Еще один тип «революционных» микроскопов функционирует, казалось бы, вопреки основным физическим принципам флуоресценции. Атомы в них возбуждаются светом с длиной волны, большей, чем у флуоресценции, а не меньшей. На самом деле никакие законы физики при работе этих микроскопов не нарушаются, просто при достаточной интенсивности светового потока с большей длиной волны в один и тот же атом одновременно могут попасть два фотона, поглощенная электронами энергия удваивается, и ее оказывается достаточно для возбуждения флуоресценции. Поэтому такие микроскопы называются двухфотонными. А поскольку световой поток максимально сконцентрирован в фокусе объектива, обеспечивается условие высокого разрешения изображений. Двухфотонные микроскопы отличает также способность регистрировать флуоресценцию в образцах на глубине до 1,5 мм и возможность существенно уменьшить неблагоприятное действие возбуждающего излучения как на исследуемые объекты, так и на флуоресцентные репортеры.

Количественную информацию из цифровых изображений извлекают с помощью компьютерных программ анализа изображений. Измеряют интенсивность флуоресценции и ее пространственное распределение, оценивают спектральные характеристики излучения, определяют количество флуоресцирующих частиц, например клеток, характеризуют временные и поляризационные параметры флуоресценции. Специальные аналитические приемы (так называемая флуоресцентная корреляционная спектроскопия) позволяют использовать конфокальную и двухфотонную микроскопию для исследования движения даже единичных флуоресцирующих молекул!

См. также:
Огоньки под ногами
Просто добавь люциферазы (2020 №7)
Светящаяся петуния (2024 №5)

Разные разности
Липучка против трипсов
Химики ищут замену инсектицидам, подсматривая за тем, как разные растения сами защищаются от вредных насекомых. Некоторые растения выделяют липкие вещества из так называемых железистых волосков. К ним прилипают насекомые-вредители и погибают. Эта стр...
Этанол против гриппа
Во время пандемии ковида в соцсетях распространилось видео, на котором наш соотечественник демонстрировал свой метод лечения ковида — ингаляцию парами этанола. Но тогда над ним посмеялись и отмахнулись. Похоже — зря. Японские исследователи ...
Пишут, что...
…за последнее десятилетие плотность тихоокеанских устриц Magallana gigas в двух заливах Южной Калифорнии увеличилась в 32 раза, что совпадает с летним повышением температуры морской воды на 2–4°C… …пластырь с микроиглами против ...
Маскировка, подсказанная цикадой
Тело цикады покрывают брохосомы. Эти структуры отлично поглощают свет, тем самым помогая ей маскироваться от животных, глаза которых видят в том числе и ультрафиолетовый свет. Используя 3D-принтер, исследователи создали искусственные аналоги брохосом...