А у нас новый стресс

Иллюстрация Косты Гусалова

Перегибы в борьбе с окислением

Жизнь с биохимической точки зрения есть череда окислительно-восстановительных реакций, необходимых для выработки энергии и синтеза основных клеточных компонентов. Эти реакции ферментативные, и в роли переносчиков электронов в них выступают вспомогательные молекулы, коферменты. Самые распространенные из них — никотинамидадениндинуклеотид НАД⁺ и его восстановленная форма НАДH, а также никотинамидадениндинуклеотид фосфат НАДФ⁺ и восстановленный НАДФH.

Первая пара участвует в синтезе АТФ (окислительном фосфорилировании), вторая — в анаболических реакциях, то есть реакциях синтеза сложных соединений из более простых. Окислитель, забирающий электроны, восстанавливается; отдающий электроны восстановитель окисляется. Есть у этих коферментов и другие функции, они, в частности, поддерживают в клетке стабильную окислительно-восстановительную среду.

Как неизбежное следствие кислородного дыхания в клетке постоянно образуются активные формы кислорода (АФК), в том числе супероксид-анион О₂^•− (ион молекулы кислорода с неспаренным электроном), перекись (в современных учебниках пероксид) водорода Н₂О₂, реактивные формы азота NO^• и их производные. Эти сильные окислители серьезно попортили бы клетки, если бы не антиоксидантная защита: несколько ферментов и небольших молекул.

Однако же и совсем без АФК нельзя. Они участвуют во многих биологических процессах, таких как передача внутриклеточных сигналов, клеточное деление и дифференцировка. И в физиологических условиях количество окислителей поддерживается на определенном уровне. Но бывает, что баланс между окислителями и антиоксидантами нарушается, равновесие смещается в ту или иную сторону и возникает стресс: либо окислительный, либо восстановительный.

Про окислительный стресс известно немало (см. «Химию и жизнь» 2018 №5). Он развивается, когда не справляется антиоксидантная защита. Восстановительный стресс изучен гораздо хуже. Одной из причин его возникновения специалисты считают избыточную и неправильную компенсацию непрерывных окислительных повреждений. Другая причина — гипоксия, при которой из-за недостатка кислорода уменьшается количество окисленных переносчиков электронов. Кислородное голодание приводит к дисфункции митохондрий и подавляет окисление НАДН, которое могло бы противодействовать вызванному гипоксией восстановительному стрессу. Зато когда поступление кислорода возобновляется, происходит всплеск образования АФК.

Восстановительный стресс можно диагностировать, измеряя соотношения НАДН/НАД⁺ и НАДФ/НАДФ⁺. Другими показателями служат относительное содержание лактата и пирувата, которое зависит от окислительно-восстановительной среды внутри клетки, а также соотношение восстановленной и окисленной форм глутатиона.

Стресс на то и стресс, чтобы не проходить без последствий. Избыток окислителей связывают с нарушением клеточных функций и развитием сердечно-сосудистых, нейродегенеративных и онкологических заболеваний, а также со старением. Последствия восстановительного стресса сейчас активно исследуют.

Поскольку восстановительный стресс подавляет образование АФК в митохондриях, их уровень становится ниже физиологического, а они выполняют разные сигнальные функции. Следовательно, многие процессы в клетке идут неверно. В том числе при восстановительном стрессе неправильно формируются дисульфидные связи мембранных и секреторных белков, соответственно, нарушается их структура и транспорт веществ через мембраны.

Постоянная активная работа генов, обеспечивающих антиоксидантный ответ, вредна, у мышей она вызывает кардиомиопатию.

При гипоксическом повреждении печени восстановительный стресс увеличивает высвобождение внутриклеточного железа. Повышенное количество свободного железа может усиливать окислительно-восстановительные реакции в местах, где это абсолютно не нужно, вызывая повреждения гепатоцитов. Более того, освобожденное железо приводит к образованию АФК. Активные формы кислорода могут вырабатываться и за счет частичного восстановления кислорода до супероксид-аниона. Далее возможны варианты: либо эти АФК смягчат восстановительный стресс, либо, если их слишком много, приведут к стрессу окислительному.

Восстановительный стресс часто встречается при диабете. По-видимому, при хронической гипергликемии усиливается продукция НАДН, а НАД⁺, напротив, истощается из-за сверхактивации ферментов, для работы которых требуется НАД⁺. В результате соотношение НАДН/НАД⁺ увеличивается и развивается восстановительный стресс.

НАД(Н), НАДФ(Н) и глутатион участвуют в процессе гликолиза, цикле трикарбоновых кислот, биосинтезе нуклеотидов, аминокислот и липидов, и сдвиг в соотношении этих трех окислительно-восстановительных пар неизбежно влияет на клеточный метаболизм. Эти изменения сейчас изучают, они затрагивают проницаемость мембран для электронов, репрограмирование Т-клеток иммунной системы, энергетический метаболизм клетки.

Глутатион — природный антиоксидант. Он связывается с активными формами кислорода, превращаясь в окисленную форму. Для восстановления ему нужен фермент глутатионредуктаза. Накопление восстановленного глутатиона вызывает восстановительный стресс

Болезни восстановительного стресса

Экспериментальные данные показывают, что восстановительный стресс связан с ишемией, кардиомиопатией и диабетом, он нарушает микроциркуляцию головного мозга и, по-видимому, способствует развитию нейродегенеративных заболеваний.

При нейродегенеративных болезнях белки сворачиваются неправильно и образуют агрегаты, что вызывает гибель нейронов. Эти белки в разных случаях разные. При болезни Альцгеймера агрегаты образуют тау-белок и бета-амилоид; при болезни Паркинсона — альфа-синуклеин. Еще одной отличительной чертой данных заболеваний считали окислительный стресс, а тут еще и восстановительный обнаружился.

Есть такой фермент, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа. В его задачи входит поддержание в клетке необходимого уровня восстановленного глутатиона и НАДФН. Оказалось, что у пациентов с болезнью Альцгеймера активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и уровень глутатиона почти вдвое выше, чем в норме. Повышенный уровень фермента обнаружили и в поврежденных нейронах умерших больных. Приняв во внимание эти факты, ученые из университета Валенсии под руководством профессора Хосе Винья (Jose Vina) исследовали восстановительный и окислительный стресс у тех, кто еще не заболел, но рискует.

Основным известным в настоящее время фактором риска является носительство аллеля 4 гена АроЕ. Ученые набрали здоровых добровольцев, несущих хотя бы один аллель 4 ApoE, и измерили содержание окислительно-восстановительных маркеров в крови, уровень антиоксидантных ферментов и патогенных белков в лимфоцитах. Оказалось, что у испытуемых с генотипом ApoE 4/4 соотношение НАДФН/НАДФ⁺ выше, чем у людей, не имеющих аллелей ApoE 4, а уровень окисленного глутатиона и активность антиоксидантных ферментов ниже. Эти испытуемые, здоровые и без клинических признаков когнитивных нарушений, уже активно синтезировали белки, связанные с болезнью Альцгеймера, в том числе тау-белок. Исследователи предположили, что восстановительный стресс при болезни Альцгеймера развивается еще до клинической стадии заболевания по причинам, пока неясным. После долгой и активной работы система антиоксидантной защиты истощается, и тогда возникает окислительный стресс, который принято считать одним из маркеров болезни Альцгеймера.

Эстафету подхватили американские ученые под руководством исследователя из Алабамского университета в Бирмингеме Намаккала Раджасекарана (Namakkal S. Rajasekaran). Они изучили влияние восстановительного стресса на клеточную культуру нейробластомы — опухоли, которая развивается из незрелых нервных клеток, нейробластов.

Чтобы создать в клетках восстановительную среду, в культуру добавляли сульфорафан. Стресс определяли по соотношению восстановленной и окисленной форм глутатиона. Оказалось, что и острый, и хронический восстановительный стресс нарушают сворачивание белков и вызывают их агрегацию. В этих агрегатах присутствуют белок тау, скопления которого обычны при болезни Альцгеймера, и альфа-синуклеин — патогенный белок болезни Паркинсона. Скорость агрегации белков зависит от силы восстановительного стресса: хронический стресс зловреднее краткосрочного.

При дегенерации нейронов положение может спасти образование новых клеток. В мозге взрослых людей есть две области, в которых нейрогенез происходит всю жизнь. Эти области содержат популяции покоящихся нейральных стволовых клеток, которые генерируют зрелые нейроны.

Исследователи обработали культуру клеток нейробластомы ретиноевой кислотой, которая стимулирует рост аксонов. Клетки ощетинились отростками, потом появились аксоны, и на пятый день клетки превратились в полностью сформированный нейрон с аксоном, дендритами и синапсами. Однако с клетками, которые испытывали восстановительный стресс, ничего подобного не произошло. Если пересадить их в среду без сульфорафана, нейроны образуются на шестой день после отмены препарата.

Н. Раджасекаран и его коллеги предположили, что сигналы, регулирующие дифференцировку нейронов, прооксидантные, и восстановительная среда передачу этих сигналов блокирует. Вредна она для нейронов, вредна.

Восстановительный стресс и кетогенная диета

Мы уже говорили, что окислительно-восстановительная среда внутри клетки влияет на ее метаболизм, но и питание влияет на среду. К восстановительному стрессу может привести кетогенная диета (о ней см. «Химию и жизнь» 2022 №9). Она содержит очень мало углеводов и белков и большое количество жиров. Кетогенная диета вызывает системный кетоз, при котором организм вместо глюкозы расходует жиры и белки, а печень при этом производит кетоновые тела, преимущественно ацетоацетат и 3-гидроксибутират. Кетоновые тела окисляются с образованием НАДН, и внутриклеточная среда становится восстановительной. Оказывается, и кетоновые тела, и восстановительная среда могут быть полезными при лечении опухолей.

Китайские и американские исследователи под руководством профессора Принстонского университета Джошуа Рабиновича (Joshua Rabinowitz) изучали аденокарциному протоков поджелудочной железы — заболевание, от которого быстро умирают, а стандартное лечение часто не помогает.

Опухоли для роста нужна глюкоза, причем раковым клеткам из-за генетических мутаций и дисфункции митохондрий глюкозы требуется больше, чем здоровым. А еще рост аденокарциномы стимулирует инсулин. При кетогенной диете, которая содержит мало углеводов, инсулина выделяется мало, и опухоль растет медленно. К тому же эксперименты с меченой глюкозой показали, что кетогенная диета подавляет гликолиз в раковых клетках, то есть даже то небольшое количество глюкозы, которое мышь получает с пищей, в опухоли почти не усваивается.

При недостатке глюкозы раковые клетки вынужденно переходят на питание кетоновыми телами, а именно 3-гидроксибутиратом. Добавляя мышам в корм 3-гидроксибутират, меченный дейтерием, ученые обнаружили, что в тканях опухоли он окисляется, превращаясь в ацетоацетат. Это однонаправленный процесс. Опухоль поджелудочной железы кровью снабжается плохо, и в таких условиях НАДН накапливается, что приводит к восстановительному стрессу. Повышение концентрации НАДН при этом умеренное и не влияет на роль опухоли. Однако сочетание кетогенной диеты и цитотоксической химиотерапии существенно повышает уровень НАДН в опухоли и тормозит ее рост.

Химиотерапия продлевала жизнь больных мышей в среднем на 5,8 дня, а у мышей на кетогенной диете — на 16 дней. Этот выигрыш во времени был связан с некрозом опухоли и замедлением клеточного деления. Эффект зависел от величины восстановительного стресса: чем выше было соотношение НАДН/НАД⁺, тем медленнее росла опухоль, а в некоторых случаях она даже уменьшалась в размерах. Эти данные получены в рандомизированных исследованиях на 66 мышах.

Джошуа Рабинович с коллегами начинают клиническое испытание комбинации химиотерапии и кетогенной диеты при метастатическом раке поджелудочной железы. Каковы будут результаты — неизвестно, поскольку в лаборатории исследователи работали с генетически модифицированными мышами, у которых спонтанно развивается рак поджелудочной железы, или с мышами, которым пересаживали фрагменты опухоли. У этих грызунов отсутствует полный спектр мутаций, обнаруживаемых при раке поджелудочной железы человека.

Традиционно считается, что восстановительная среда полезна для клетки, так как окисление может привести к повреждению белков, липидов и нуклеиновых кислот. При некоторых заболеваниях даже рекомендуют антиоксидантную терапию для компенсации окислительного стресса. Слово «антиоксидант» воспринимается исключительно в положительном смысле. Однако практика показывает, что избыток восстановленных соединений, таких как НАДН или глутатион, также вреден для клетки. Он приводит к окислению митохондрий, высвобождению железа, образованию активных форм кислорода, агрегации некоторых белков, изменяет работу генов и даже может со временем сдвинуть окислительно-восстановительный баланс в сторону окислительного стресса. Все эти изменения токсичны для клетки и вызывают болезни. Что касается пользы восстановительного стресса в лечении злокачественных опухолей, то для людей она пока не доказана.

Регуляция окислительно-восстановительной среды и ее влияние на различные заболевания — сложный процесс, в котором антиоксиданты требуются только в крайнем случае. А некоторые исследователи, в том числе Хосе Винья, полагают, что использование антиоксидантов как пищевых добавок и лекарственных препаратов при заболеваниях, связанных с окислительным стрессом, неразумно. Так что клеткам млекопитающих лучше поддерживать сбалансированную окислительно-восстановительную среду, чтобы избежать как окислительного, так и восстановительного стресса.