Редактирование человека: часто вместо целого

Клещенко Е.
(«ХиЖ», 2016, №12)

Весной прошлого года мы вместе со всем человечеством обсуждали сенсационную новость — попытку китайских ученых редактировать геном человеческого эмбриона (см. «Химию и жизнь», 2015, 6). Этические требования были соблюдены; команда исследователей под руководством Цзюньцзю Хуана (Университет Сунь Ятсена, Гуанчжоу) взяла для эксперимента нежизнеспособные эмбрионы, которые проходят лишь несколько делений и затем погибают. Результат был не блестящим: замены в геноме произошли не везде, где были нужны, зато кое-где обнаружились лишние замены. Стало ясно, что до массовых генных модификаций людей еще очень далеко. Тем не менее эта работа вызвала бурные споры о возможных последствиях, ближних и отдаленных, и о необходимых мерах предосторожности.

Теперь CRISPR/Cas9 опять в первых строчках новостей. Героями дня снова стали китайские ученые, но они выбрали менее масштабную задачу и, пожалуй, более практичную: взять из организма отдельные клетки, модифицировать их геном и вернуть в организм.

s 20161202 crispr.jpg

Клетки-супермутанты против рака и СПИДа

Тяжело лечить болезнь, когда врачу не помогает иммунная система пациента. Вирус иммунодефицита человека тем и страшен, что поражает клетки иммунной системы, делая больного беззащитным и против собственно ВИЧ, и против других инфекций. Раковые клетки не становятся мишенью иммунной системы по другой причине: они хотя и вредные, но «свои», к тому же умеют уходить из-под удара.

Ключевое звено иммунного ответа — Т-лимфоциты: именно они распознают чужеродные антигены, а одна из их разновидностей, Т-киллеры, убивает инфицированные и опухолевые клетки. Механизм истребления, пусть и вредных объектов, должен как-то контролироваться, иметь выключатели. Вот если бы застопорить эти выключатели, чтобы Т-клетки беспощадно расправились с опухолями, как с занозой или простудой, истребили до последней клетки... Еще недавно такая идея казалась фантастичной. Теперь ясно, что это вполне можно сделать, и в общих чертах понятно как.

Схема опыта выглядит несложной: взять кровь у пациента, если возможно — недалеко от опухоли, извлечь из нее Т-лимфоциты, подредактировать их гены, размножить клетки в культуре и затем ввести их пациенту — живой антираковый препарат, приготовленный для него лично.

Двадцать первого июня 2016 года консультативный комитет Национальных институтов здоровья США одобрил предложение использовать для лечения рака Т-лимфоциты, геном которых модифицирован с помощью CRISPR/Cas9. Исследователи возьмут Т-клетки у 18 пациентов с различными типами рака (миеломой, саркомой, меланомой) и выполнят редактирование их генов. Отредактированные клетки получат в Университете штата Пенсильвания. В программе также участвуют Университет штата Калифорния (Сан-Франциско) и Техасский университет (Хьюстон) — в медицинских центрах Калифорнии и Техаса будут проводить лечение. Программа рассчитана два три года, причем  приоритетной задачей станет доказательство безопасности метода. Карл Джун, заведующий лабораторией в Пенсильванском университете¸ научный советник проекта, сообщил, что он должен начаться уже в конце 2016 года.

Какие гены будут редактировать? Первая мишень — поверхностный белок Т-лимфоцитов PD-1 (Programmed cell death 1). Он ослабляет Т-клеточную активность после иммунного ответа —  через него запускается апоптоз антигенспецифичных Т-клеток и одновременно подавляется апоптоз Т-супрессоров, отвечающих за толерантность к «своим».  Опухолевые клетки научились дотягиваться до этого выключателя лимфоцитов, поэтому многие противоопухолевые препараты действуют как ингибиторы PD-1. Но совсем лишить Т-лимфоциты этого регулятора, сделать их неуязвимыми и беспощадными — еще более радикальное решение! Кроме того, Т-лимфоцитам планируют дать рецепторы к белку, характерному для опухолевых клеток, но не для здоровых. Гены же собственных первичных (специфических) рецепторов будут удалены, чтобы сделать новый рецептор более эффективным. Вот таким генно-модифицированным клеткам, неумолимым убийцам рака, дадут размножиться в культуре и вернут их в организм пациента.

Как мы уже не раз отмечали, CRISPR/Cas9  — удобный метод редактирования, но не единственный: нечто подобное уже делали. Джун с коллегами создали и испытали ряд терапевтических модификаций Т-лимфоцитов, используя для редактирования геномов лентивирусы и нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN). Например, брали кровь у 12 пациентов с ВИЧ, выделяли Т-лимфоциты и повреждали у них ген белка, с помощью которого ВИЧ проникает в клетку (корецептора ВИЧ CCR5). Результаты были обнадеживающими: количество лимфоцитов в крови пациентов резко выросло, а вирусной РНК и ДНК — уменьшилось («The New England Journal of Medicine», 2014, 370, 901—910, doi: 10.1056/NEJMoa1300662). Правда, наблюдались малоприятные побочные эффекты — лихорадка, озноб (что бывает и при обыкновенном переливании крови), боли в мышцах и суставах. Из необычного — многие пациенты жаловались на неприятный «чесночный» запах собственного тела, очевидно, из-за того, что клеточные культуры консервировали в среде с диметилсульфоксидом: и само это вещество, и его метаболиты пахнут незабываемо. Эту технологию продолжает развивать американская компания «Sangamo» (http://www.sangamo.com/).

Год назад все писали о том, как в лондонском детском госпитале «Грейт-Ормонд-Стрит» спасли годовалую девочку Лейлу Ричардс, у которой был острый лимфобластный лейкоз. Ей ввели генно-модифицированные донорские лимфоциты, подавляющие развитие опухолевых клеток, и это позволило ребенку дожить до пересадки подходящего костного мозга. Других способов не было — химиотерапия таким малышам помогает плохо, собственно, поэтому новаторский метод лечения и разрешили. Клетки делали в компании «Селлектик» (http://www.cellectis.com/). При этом использовали еще одну систему редактирования генома — TALEN. В «Грейт-Ормонд-Стрит» планируют продолжать эти исследования с более широкой группой пациентов и с упором на безопасность.

Во всех этих случаях применялась технология ex vivo — клетки модифицировали вне организма. Однако не все наши клетки можно вынуть и потом вернуть назад. Поэтому есть альтернативный вариант, in vivo — система редактирования доставляется в организм, например, с помощью вирусного вектора или в липидных наночастицах и производит редактирование на месте. Именно таким способом планирует исправлять гены в сетчатке глаза американская компания «Editas» (www.editasmedicine.com) —  это один из самых заметных игроков среди разработчиков медицинских применений CRISPR-Cas9. Среди ее основателей — двое изобретателей метода, Дженифер Дудна из Калифорнийского университета в Беркли и Фэн Чжан из Института Брода. (Позднее Дудна покинула компанию, чтобы создать ее конкурента — «Caribou Biosciences».) Так вот, в «Editas» решили сосредоточиться на генетических заболеваниях, для которых сейчас не существует эффективного лечения: муковисцидозе, миодистрофии Дюшенна, бета-талассемии, серповидноклеточной анемии, а также редких формах слепоты. При амаврозе Лебера зрение ослабевает или пропадает еще в раннем возрасте, но этот процесс можно остановить, исправив мутацию в дефектном гене. К сожалению, эту болезнь трудно захватить вовремя — младенец не может сказать, что плохо видит, и пока родители заметят, что дитя вяло реагирует на лица и яркие игрушки, время бывает упущено, — но лучше ослабленное зрение, чем «черный экран».

Умные люди из Сычуани

Итак, множество компаний по всему миру еще летом выступили с заявлениями о том, что начнут лечить людей с помощью CRISPR-Cas9 не позднее, чем в 2017 году. Но всех опередили китайские ученые. В июле команда под руководством Лу Ю (Lu You), онколога из Западнокитайского госпиталя Сычуаньского университета в Чэнду, сообщила, что уже готова вводить больным, страдающим раком легких, Т-клетки, модифицированные этим методом. Комментируя заявление конкурентов, Карл Джун признал, что «это потрясающий шаг вперед». Он же назвал международную гонку CRISPR-технологий «Спутник 2.0» — по ассоциации с космическим состязанием СССР и США, «биомедицинской дуэлью во имя прогресса». Конечно, сычуаньский проект в Китае не единственный: так, в Пекинском университете планируют начать испытания CRISPR-Cas9 — модификаций против раков мочевого пузыря, простаты и почек.

Метастазирующий немелкоклеточный рак легких плохо поддается лечению известными методами, поэтому клиницисты с нетерпением ждут результатов CRISPR-Cas9-терапии. Китайские ученые также выбрали в качестве мишени ген белка PD-1 (и только его), и они надеются, что модифицированные Т-лимфоциты выполнят свою задачу. Биотехнологическая компания «Chengdu MedGenCell», со своей стороны, обязуется тщательно контролировать вопросы безопасности. Дело тут не только в возможной неточности редактирования: Т-клетки вовлечены в разные типы иммунного ответа, в том числе, например, неспецифический, и есть опасение, не вызовет ли модификация аутоиммунные реакции. (При терапии антителами к PD-1 аутоиммунной реакции не было, но мало ли...) 

Некоторые комментаторы говорят, что Китай продвигается в этой области слишком стремительно: первые обезьяны с геномом, модифицированным CRISPR-Cas9, первые опыты с эмбрионами человека... Однако команда Лу Ю не собирается спешить. Первая фаза клинических испытаний (десять человек, три варианта дозирования) должна будет показать, безопасна ли терапия. Компания планирует начать с одного пациента и постепенно увеличивать дозу, тщательно отслеживая побочные эффекты.

Лу Ю с коллегами получили разрешение еще летом, но первая инъекция модифицированных клеток пациенту в итоге была сделана лишь 28 октября 2016 года. Начать терапию в августе, согласно первоначальному плану, не получилось: культивирование клеток заняло много времени.

Многократное повторение слова «безопасность» имеет основания. Да, другие методы генной модификации клеток показали себя неплохо. Да, хочется скорее перейти к более простому, дешевому и потенциально общедоступному CRISPR-Cas9. Однако когда готовился этот материал, пришли печальные новости. На второй фазе клинических испытаний американской компании «Juno Therapeutics» (лечение острого лимфобластного лейкоза у взрослых с помощью отредактированных Т-лимфоцитов, https://junotherapeutics.com) у двух пациентов развился отек мозга; один скончался, другой, по-видимому, также не выживет. Эти испытания (но не другие аналогичные) приостановлены до полного выяснения обстоятельств, и споры разгораются с новой силой.

А что же Россия, или «Спутник 2.0» взлетает без нас? История исследования CRISPR связана с именами Евгения Кунина и Константина Северинова (Евгений Викторович давно работает в США, но сохранил контакты с российскими коллегами, и наши рейтинги неизменно указывают его первым по индексу Хирша среди отечественных биологов). Технологию CRISPR-Cas9 используют в экспериментах, например, в лаборатории геномной инженерии МФТИ. С помощью этой технологии московская компания «Marlin Biotech» создала новую мышиную модель миодистрофии Дюшенна — на мышах с симптомами этого тяжелого заболевания можно испытывать потенциальные лекарства. О проектах, подобных тем, о которых рассказывается в этой статье, пока не слышно.

Разные разности

18.11.2016 20:43:00

«Сейчас ко мне пришел Щербаков, злой, как черт, и сообщил, что банда этих механических идиотов (его собственные слова) сегодня ночью растащила один из крупных складов руды, приняв его, очевидно, за необычайно богатое месторождение. Программы у роботов были разные, поэтому к утру часть склада оказалась в пакгаузах ракетодрома, часть — у входа в геологическое управление, а часть вообще неизвестно где. Поиски продолжаются» (А. и Б. Стругацкие. Страна багровых туч). Хорошо было фантастам шутить о тупости роботов в не предвиденных программой обстоятельствах, а нам с этим жить.

>>
16.11.2016 20:39:00
Казалось бы, принадлежность к политической партии не должна сказываться на мнении о таком предмете, как глобальное изменение климата. Ан нет: американские социологи отмечают, что отношение к этой проблеме сегодня разделяет избирателей в той же степени, как отношение к абортам или свободной продаже оружия. >>
14.11.2016 20:35:00
...по результатам 21 исследования из 27, излучение на частотах, характерных для мобильных телефонов, негативно влияет на мужскую репродуктивную систему, в частности снижается подвижность сперматозоидов, увеличиваются производство активных форм кислорода и частота повреждений ДНК («Reproduction», 2016, doi: 10.1530/ REP-16-0126)... >>
11.11.2016 15:28:00

...Китай запустил «Тяньгун-2», свою вторую орбитальную лабораторию; пока она необитаема, но в ноябре туда отправятся два человека («Nature», 2016, doi: 10.1038/ nature.2016.20611)...

>>
29.10.2016 23:11:00

...создан биоробот в виде ската, плавники которого приводятся в движение светом; его тельце сделано из эластомера, а мышцы из клеток эмбрионов крысы («Science», 2016, 353, 6295, 158—162, doi: 10.1126/science.aaf4292)... 

>>