Диагностическая Одиссея

Сегодня генетика все больше проникает в нашу повседневную жизнь, прежде всего – в медицину, делая ее не одинаковой для всех, а индивидуальной для каждого пациента. Генетическая диагностика расширяет представления врачей о болезни, помогает поставить диагноз и дает ориентиры для оптимального лечения. Ее используют в разных областях медицины, прежде всего в онкологии, где она дает возможность прицельного лечения. Но, пожалуй, с наибольшим успехом – в репродуктивной медицине и педиатрии. Все стороны и проблемы этой области обсуждали на недавнем симпозиуме «Genetico.Kids», организованном Центром генетики и репродуктивной медицины «Genetico». Специалисты по медицинской генетике делились с врачами-педиатрами знаниями и опытом генетического тестирования и генетической диагностики. Мы использовали материалы этой конференции, а также беседу с медицинским директором «Genetico» Елизаветой Мусатовой, чтобы разобраться в молекулярно-генетических методах, которые могут обеспечить рождение здорового ребенка. 
Представим, что семейная пара планирует завести ребенка и, разумеется, хочет, чтобы он родился здоровым. Для этого они могут использовать генетическое тестирование. Посмотрим, какие возможности для этого есть сегодня.

Этап первый: до зачатия

Все лабораторные операции медицинские генетики проводят в ламинарном боксе, в стерильных условиях – под ультрафиолетовыми лампами и в потоке стерильного воздуха. И конечно, в перчатках

Вариант 1. Самая частая ситуация – оба партнера здоровы и нет очевидной «плохой наследственности», зафиксированной в семейной истории. Но не прячутся ли в их геномах скрытые мутации, которые могут вызывать те или иные заболевания у будущего потомства? Допустим, что у мамы и папы имеется мутация в одном и том же гене, но лишь на одной хромосоме из двух парных. Для болезни этой одной мутации недостаточно, поэтому родители здоровы. Если же в геноме ребенка объединятся мутантные гены от мамы и от папы, то мутация проявит себя заболеванием. По законам наследования Менделя, вероятность этого события составляет 25%. Чтобы узнать возможные риски, семейная пара перед зачатием ребенка может пройти так называемый «преконцепционный генетический скрининг» на носительство скрытых мутаций. В обязательное медицинское страхование (ОМС) он не входит, так что делать его придется за свой счет.
Как объясняет Елизавета Мусатова, в преконцепционный генетический скрининг может быть включено тестирование на мутации в разном количестве генов. Есть вариант этнического скрининга, в него входят мутации, которые с высокой частотой встречаются в том или ином этносе. Но сейчас этот вариант не слишком популярен – много смешанных браков, и не каждый человек знает свою родословную. Чаще используют универсальный скрининг. Сколько генов и мутаций в него включить, зависит от возможностей семейной пары: чем больше, тем дороже. Но есть такие гены, которые в первую очередь стоит проверить на наличие мутаций. Для европейской популяции, объясняет Елизавета Мусатова, это мутации, связанные с частыми, тяжелыми, рецессивными наследственными заболеваниями – муковисцидозом и спинальной мышечной атрофией. Муковисцидоз – болезнь, в первую очередь поражающая дыхательную систему. Муковисцидоз развивается из-за мутаций в гене CFTR на 7-й хромосоме. Его частота различна в разных странах, в России она случается в одном случае на 10 тысяч новорожденных. Но это немало: как пишет профессор Николай Иванович Капранов, научный консультант Российского центра муковисцидоза, «каждую неделю у нас в стране рождается семь детей, больных муковисцидозом». Спинальная мышечная атрофия – болезнь, о которой в последнее время много говорят в связи с недоступностью лекарств. Она связана с поражением двигательных нейронов спинного мозга; с этой болезнью рождается один ребенок на 6–10 тысяч. Ее вызывает мутация гена SMN1 на 5-й хромосоме. 
Все скрининговые генетические тесты учитывают разумный баланс цены и эффективности. Например, в лаборатории «Genetico» предлагают скрининговый генетический тест, который включает 54 патогенные мутации, связанные с развитием 26 наследственных заболеваний, в том числе спинальной мышечной атрофии, муковисцидоза и других болезней с тяжелыми симптомами и высокой смертностью. При его разработке учитывали как общемировые рекомендации, так и особенности российской популяции. Стоит он 15 тысяч рублей. Включенные в него гены проверяют на разное число мутаций. В гене спинальной мышечной атрофии SMN1 ищут одну мутацию, именно она в подавляющем большинстве случаев приводит к болезни. С геном муковисцидоза CFTR сложнее – в нем описано более 1500 мутаций, в тест включены 10 частых. Ген муковисцидоза можно прочитать и целиком, чтобы выявить в нем все возможные мутации. Но это будет дороже – около 30 тысяч рублей, потому что в этом случае используют секвенирование.

Вариант 2. Один или оба партнера знают о «плохой наследственности» – в их роду были случаи наследственного заболевания.  Если известен диагноз и это моногенное заболевание, то есть определяемое мутациями в одном гене, то им нужно уже в обязательном порядке протестироваться на носительство мутаций в этом гене. Каков риск, что мутация передастся ребенку и он родится с заболеванием? Напомним, что варианты генов – аллели – могут быть доминантными или рецессивными. Доминантный аллель подавляет рецессивный. Поэтому доминантный вариант (мутация) проявляет себя в любом случае, а рецессивный аллель (мутация) – только если присутствует на обеих хромосомах. Если мутация доминантная, то риск ее передачи от одного родителя составляет 50%, таков же и риск заболевания. Если мутация рецессивная, то риск заболевания ребенка – 25%, и только в том случае, если мутация имеется у обоих родителей. Риски будут иными при наследовании, сцепленном с полом, например, если мутация находится на Х-хромосоме. 

Важно, что риск один и тот же для каждой беременности. «Если в семье уже есть больной ребенок, это не значит, что при следующей беременности риск уменьшится, – объясняет Елизавета Мусатова. – Точно так же, если в семье уже есть здоровый ребенок, это не значит, что нет рисков для следующего». Могут быть вызывающие заболевания мутации в двух или более генах, и наследуются они независимо друг от друга. 
Кстати, в случае семейного наследственного заболевания или если родился ребенок с генетическим заболеванием, при планировании беременности родители могут обратиться за проведением преконцепционного скрининга на бюджетной основе в федеральный или региональный медико-генетический центр, имея на руках направление и все медицинские документы. По федеральным квотам на высокотехнологическую медицинскую помощь по профилю «Генетика» работают, например, Медико-генетический научный центр (МГНЦ) в Москве, НИИ медицинской генетики в Томске. 
Итак, будущие родители провели преконцепционный скрининг. И получили результат А или В. Результат А означает, что у одного партнера найдена вредная рецессивная мутация в одном из двух копий гена, у другого партнера этой мутации нет. В этом случае мутация может передаться ребенку, но болезнь не возникнет. Полезно, если он или она будут знать о своем носительстве до момента, когда соберутся планировать собственных детей. 
Результат В говорит о том, что у одного партнера найдена вредная доминантная мутация (в этом случае он, как правило, заведомо знает о своей болезни) либо у обоих партнеров найдены рецессивные мутации в одном и том же гене. Сегодня это не приговор – у такой семейной пары есть возможность иметь здорового ребенка. Можно прибегнуть к экстракорпоральному оплодотворению (ЭКО) в сочетании с преимплантационным генетическим тестированием (ПГТ). Эта процедура заключается в отборе эмбрионов, которые получаются после оплодотворения «в пробирке». Анализ ДНК эмбрионов позволяет выбрать те из них, которые не содержат мутаций, и именно их использовать для переноса в матку. Чтобы сделать ПГТ, придется обратиться в одну из немногочисленных лабораторий в крупных городах, пока их можно пересчитать по пальцам одной руки – в Москве, Петербурге, Томске. Однако налажена логистика, так что лаборатории работают с пациентами и из других городов России. 
«Из всех методов, которые позволяют снизить риск рождения больного ребенка, ПГТ – наиболее щадящий, потому что он выявляет этот риск до наступления беременности, – подчеркивает Елизавета Мусатова. – Это очень важно для тех семейных пар, которым уже приходилось по этой причине прерывать беременность». 
Точность ПГТ сегодня высока, хотя и не стопроцентна. И про деньги – в то время как ЭКО с 2019 года в России входит в систему ОМС, преимплантационное генетическое тестирование пока можно провести только за свой счет.

Этап второй: во время беременности

Заглянем внутрь секвенатора. Это полимер для проведения секвенирования по методу Сенгера

Вариант 1. Если перед беременностью пара не проходила преконцепционный генетический скрининг, то его можно сделать сейчас – лучше поздно, чем никогда, лучше узнать о риске позже, чем не узнать совсем. Напомним, что при этом исследуется ДНК будущих родителей на наличие скрытых мутаций.

Вариант 2. Сегодня можно во время беременности сделать неинвазивный пренатальный скрининг плода на доминантные мутации. Для этого берут кровь у мамы и исследуют содержащуюся в ней в небольшом количестве ДНК клеток плода. «Но, – подчеркивает Елизавета Мусатова, – таким способом, неинвазивно, можно выявить именно доминантные патологии у плода». Например, можно найти доминантную мутацию, вызывающую ахондроплазию – нарушение развития костей, ведущее к карликовости. В ходе неинвазивного пренатального скрининга выявляется высокий риск мутаций «de novo», которых не было у родителей, но они возникли у ребенка. Откуда? А от того, что появились в процессе созревания половых клеток – яйцеклетки или сперматозоида. И это именно те мутации, которые невозможно предугадать при тестировании родителей. В обязательное медицинское страхование такой скрининг тоже, к сожалению, не входит.

Вариант 3. УЗИ во время беременности показало что-то похожее на генетическую патологию. В этом случае пациентку направляют на консультацию к врачу-генетику. Врач предлагает тестирование на хромосомные аномалии (например, на лишнюю копию 21-й хромосомы, вызывающую болезнь Дауна), но может и порекомендовать тестирование на ту или иную моногенную патологию. Это тестирование проводят инвазивным способом: ДНК ребенка выделяют, например, из околоплодной жидкости. Объем тестирования определяет врач-генетик: можно ограничиться исследованием одного гена, можно сделать NGS секвенирование всего экзома. Пренатальное тестирование инвазивным способом на мутации в конкретном гене можно попробовать провести по бюджетным квотам, если есть основание – подозрение на генетическую патологию по результатам УЗИ или биохимических анализов.

Этап третий: ребенок родился

Сегодня полимеразную цепную реакцию (ПЦР) можно проводить на таком микрочипе. В ходе микрофлюидной ПЦР реакционная смесь проходит через микроканалы, в которых она нагревается и охлаждается

Всех новорожденных в обязательном порядке тестируют на риск некоторых заболеваний. Это называется неонатальный скрининг, и он предусмотрен обязательным медицинским страхованием. На первом этапе он, строго говоря, не генетический, а биохимический: в крови ищут биохимические маркеры заболеваний. Сегодня в обязательный скрининг входят маркеры пяти заболеваний: фенилкетонурии, муковисцидоза, галактоземии, адреногенитального синдрома и врожденного гипотиреоза. Почему эти пять? Как объяснила Екатерина Захарова, заведующая лабораторией наследственных болезней обмена веществ МГНЦ, четыре из них можно держать под контролем за счет лекарств и диеты. Муковисцидоз, к сожалению, нет, но в этом случае раннее начало лечения заметно улучшает качество жизни.
Если найден биохимический маркер болезни, то проводят и генетическое тестирование, чтобы найти ключевую мутацию. Список заболеваний для неонатального тестирования в Москве приказом московского Департамента здравоохранения с 2018 года расширен до 11 наименований. Специалисты пытаются добиться, чтобы в список неонатального скрининга вошло 30 заболеваний, но пока государство на это денег не выделяет. Для сравнения: в Европе новорожденных проверяют на 15–20 генетических болезней, в США – на 30–50. В Великобритании в ближайшем будущем всем новорожденным планируют делать полное секвенирование генома.

Если у ребенка болезнь

Секвенатор Illumina используется для прочтения нуклеотидной последовательности гена, экзома или полного генома методом NGS (секвенирование нового поколения). Этот метод позволяет одновременно читать множество участков ДНК

Как проверить, не имеет ли она генетической природы? Это важно знать для точной постановки диагноза. Выступая на симпозиуме «Genetico», врач-генетик Наталья Ветрова перечислила «красные флажки», на которые надо обратить внимание. Это прогрессирующий характер заболевания; наличие родственников с подобными симптомами; близкородственный брак родителей; мультисистемный характер болезни – нарушения в разных органах; наконец, неэффективность терапии. По этим признакам врач-генетик может заподозрить, что причина болезни – в неправильно работающем гене, и задача состоит в том, чтобы найти этот ген и эту мутацию. И здесь очень важно правильно выбрать метод обследования, чтобы оно не превращалась, по выражению специалистов, в «диагностическую одиссею». 
На сегодня врачам известно 3216 рецессивных и 2617 доминантных генетических заболеваний, за которые отвечают около 6 тысяч генов. По статистике, каждый 50-й человек на планете имеет наследственные заболевания (к счастью, не все из них относятся к тяжелым и радикально снижают качество жизни). В арсенале генетической диагностики много методов, у каждого свои преимущества и ограничения. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) применяют, когда надо найти одну мутацию или проверить несколько конкретных мутаций, причем если речь идет о точечных заменах нуклеотидов. Метод секвенирования по Сенгеру дает возможность прочитать ген целиком или его наиболее значимые участки, в которых мы опять же находим точечные или непротяженные мутации. Есть еще тестирование на ДНК-микрочипах, которые содержат зонды на определенный набор мутаций – кому-то нужно посмотреть 20 точек, кому-то 120. Для более масштабного прочтения ДНК используют метод секвенирования NGS. Можно прочитать в геноме все участки, кодирующие белки, экзома. По размеру он составляет всего лишь 1% от всего генома, хотя при этом именно в экзоме содержится 85% патогенных мутаций. Сегодня средняя цена секвенирования экзома составляет около 60 тысяч рублей. Несколько уменьшенный вариант включает только те кодирующие белки участки, которые ассоциированы с известными заболеваниями, это называется клиническим экзомом. 
Наконец, самый полный вариант тестирования – секвенирование всего генома. Это намного более объемное исследование, чем секвенирование экзома, но при этом специалист получает информацию обо всех мутациях, не только в кодирующей, но и в некодирующей части ДНК. В некоторых случаях именно такое полное прочтение ДНК позволяет найти генетическую причину заболевания. Однако есть и ограничения – секвенирование NGS одинаково хорошо выявляет не все генетические изменения– уже говорилось, что этот метод плохо ловит протяженные выпадения и удвоения фрагментов ДНК, за скобками также остается увеличение числа повторяющихся фрагментов. С другой стороны, при этом появляется много разной информации, иногда даже слишком много, и врачу-генетику нужно понять, как с ней поступить. Минус  секвенирования генома – в его высокой стоимости (сегодня это 90—100 тысяч рублей). И все же даже этот метод, по словам Елизаветы Мусатовой, не обладает исключающей силой – можно подтвердить генетическую патологию, но не исключить ее.
В вопросах генетического тестирования специалисты не приветствуют самодеятельность. «Бывают случаи, когда пациент назначает генетическое тестирование сам себе или родители назначают его ребенку. И с уже полученными результатами семья приходит на прием, – говорит Мусатова. Но только врач-генетик может разъяснить пациенту возможности и ограничения того или иного метода и какой результат можно с его помощью получить. И сделать это имеет смысл на предварительной консультации». Кстати, врачей-генетиков в нашей стране не так уж много – по информации МГНЦ, сегодня всего лишь около 450 врачей имеют сертификат «Генетика». Далеко не во всех медицинских вузах есть такая специализация. Специалисты считают, что при обучении студентов-медиков генетике уделяется слишком мало внимания, хотя ее знание и понимание необходимы врачам всех направлений.
Результаты тестирования надо правильно интерпретировать. Любой генетический вариант, обнаруженный при тестировании, относят к той или иной категории: патогенный, вероятно патогенный, доброкачественный или неизвестной клинической значимости.  При секвенировании NGS  специалисты могут столкнуться со случайными находками. Случайные находки не связаны с заболеванием, которое стало причиной тестирования. Например, врач ищет мутации, вызывающие поликистоз почек. Но случайно может обнаружиться, что у пациента есть мутация, которая через какое-то время приведет к необратимым изменениям зрения или нейродегенеративным изменениям. Эта информация не связана с исходной целью, но она значимая. Сообщать ли такую информацию, и хочет ли пациент ее знать – это проблема, у которой нет общего решения. «Как правило, при тестировании детей случайные находки не сообщаются», – говорит Елизавета Мусатова. Наконец, при полногеномном или полноэкзомном секвенировании может появиться информация, которую специалисты пока еще не могут интерпретировать, так называемая информация неизвестного клинического значения. Главное, что она не должна использоваться для принятия клинически значимых решений Врач-генетик интерпретирует результаты генетического тестирования и выдает пациенту заключение. 
И немного о финансовой доступности генетической диагностики заболеваний. Федеральные центры, например Медико-генетический научный центр (МГНЦ) или Томский НИИ медицинской генетики, проводят диагностическое обследование пациентов с наследственными заболеваниями по бюджетным квотам. На сайте МГНЦ можно найти документ с перечнем оснований для амбулаторного приема пациентов на бюджетной основе. В список заболеваний, по которым МГНЦ проводит генетическую диагностику, включено 447 наименований. Например, в 2018 году в МГНЦ получили генетическую консультацию более 12 тысяч семей, в которых есть пациенты с подозрением на наследственные заболевания. Однако этого явно недостаточно. На симпозиуме «Genetico.Kids» не раз поднимался вопрос, что в стране не хватает системы комплексной государственной бесплатной генетической помощи.
Вопросов лечения генетических наследственных заболеваний мы здесь касаться не будем, это отдельная история. Если у ребенка редкое (орфанное) заболевание, то история очень болезненная, главным образом из-за недостаточной доступности лекарств или их отсутствия как таковых. Как правило, родителям с детьми не обойтись без помощи благотворительных фондов, а также информационной и психологической поддержки пациентских организаций.

Словарик

Секвенирование NGS – секвенирование нового поколения. В отличие от более ранних подходов, позволяет прочитать последовательность нуклеотидов сразу множества участков генома, его называют также «параллельным секвенированием». В большинстве методов NGS ДНК нарезают на фрагменты в несколько сотен нуклеотидов, читают эти кусочки, а затем соединяют в единую последовательность. К методам NGS  относятся: пиросеквенирование, секвенирование Illumina, ионное полупроводниковое секвенирование (IonTorrent) и другие. 

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод, произведший революцию в молекулярной биологии, поскольку позволяет многократно увеличить количество определенного фрагмента ДНК в пробе, это называется амплификацией. Нужный фрагмент ДНК ограничивается короткими олигонуклеотидами – праймерами. Фермент ДНК-полимераза катализирует реакцию полимеризации – многократного умножения участка. ПЦР проводят в амплификаторе – приборе, который обеспечивает периодическое охлаждение и нагревание пробирок с пробами. Продукт ПЦР анализируют различными методами, например, подвергают электрофорезу в геле и по наличию полоски в определенном месте делают вывод о наличии мутации.; или проводят секвенирование нужного фрагмента ДНК. 

Секвенирование по Сенгеру – первый метод секвенирования ДНК, изобретенный Фредериком Сенгером еще в 70-е годы прошлого века, в автоматизированном виде применяется и в наше время. Его называют также методом «обрыва цепи», так как он основан на разделении молекул ДНК, оканчивающихся на разные нуклеотиды. В современном секвенаторе (например, Applied Biosystems) применяется капиллярный электрофорез, и на выходе прибор выдает график с четырьмя кривыми разного цвета, обозначающий последовательность нуклеотидов. 

ДНК-микрочипы – устройство, в котором множество небольших одноцепочечных последовательностей нуклеотидов, ДНК-зондов, прикреплено к твердому основанию. Эти зонды гибридизуются с соответствующими фрагментами ДНК в пробе. Их наличие выявляют по флуоресцентным меткам, которые предварительно вводят в пробу. Каждый зонд выявляет одну мутацию. Зонды на микрочипе могут содержать фрагменты хромосом, и тогда этот метод можно применять для выявления хромосомных аномалий.