Записки одомашненных дрожжей

Можно ли одомашнить создание, о существовании которого даже не подозреваешь? Оказывается, можно. Именно это произошло с дрожжами Saccharomyces cerevisiae. Их способность превращать сахара в спирт и ароматные соединения люди начали совершенствовать за несколько веков до открытия этих микроорганизмов, хотя и значительно позже, чем появилось первое пиво. И этот процесс можно с полным правом назвать доместикацией.

Доместикация или домашний арест?

Процесс одомашнивания животных и культурных растений описан достаточно подробно, история взаимодействия человека с микроорганизмами, участвующими в приготовлении продуктов, почти неизвестна. Штаммы дрожжей, которые используют для производства спирта, пива и хлеба, отличаются от своих лабораторных и диких собратьев, а также друг от друга. Однако эти различия могли возникнуть не только в ходе целенаправленного отбора ценных для человека признаков, но и в результате географической изоляции дрожжей и ограниченного их разнообразия в каждой области. Если бельгийские дрожжи, однажды попав на пивоварню, никогда ее не покинут, то со временем они поневоле станут отличаться от, скажем, британских. Так чему же промышленные дрожжи обязаны своими особенностями? К сожалению, пивовары и хлебопеки древности не оставили записок, однако можно прочесть дрожжевой геном, а лучше несколько.
Доместикация — это направленный отбор по нужным человеку признакам и адаптация к определенным условиям жизни, часто весьма далеким от природных. В каком бы направлении (урожайность, окраска меха, размер тела) этот отбор ни шел, он всегда приводит к характерным изменениям, хорошо известным на примерах многих одомашненных животных и растений. У них ярко выражены признаки, полезные людям, но не нужные их обладателям (во всяком случае, не в такой степени). У них нарушено половое размножение. Эти признаки позволяют существовать в среде, созданной человеком, однако в естественных условиях  одомашненные виды чувствуют себя, в лучшем случае, некомфортно.
Доместикация оставляет характерные пометки в геноме: некоторые участки ДНК удваиваются, а другие теряются, меняется копийность генов, а иногда и целых хромосом. Иными словами, геном портится. Если генотипические и фенотипические особенности, характерные для одомашненных видов, обнаружатся и у промышленных штаммов дрожжей, это послужит доказательством их доместикации.


Дрожжевое древо

Такое исследование предприняли ученые из Бельгии и Соединенных Штатов под руководством Кевина Верстрепена, адъюнкт-профессора Католического университета Левена, и Стивена Маре из Гентского университета («Cell», 2016, 166, 1397—1410, doi: 10.1016/j.cell.2016.08.020). Они секвенировали и описали геномы 157 штаммов дрожжей S.cerevisiae, которые используют для производства теста, вина, пива, спирта, саке и биоэтанола, и сравнили их с дикими и лабораторными штаммами, собранными на разных континентах. Дрожжи могут существовать в диплоидном и гаплоидном состоянии; исследователи работали с диплоидными, чтобы оценить все особенности строения генома.
Анализ геномов показал, что промышленные дрожжи генетически отличаются от диких родичей и произошли от немногих предковых штаммов, которые адаптировались к созданной человеком среде. Исследователи составили филогенетическое древо промышленных дрожжей, которые разделяются на пять клад (рис. 1). (Клада у биологов — группа организмов, включающая общего предка и всех его прямых потомков.) Одна из них включает азиатские штаммы производителей саке, другая — преимущественно винные дрожжи. Есть одна смешанная клада, объединяющая все пекарские штаммы и некоторые пивные, в основном те, которые используют для изготовления крепкого бельгийского эля. Выделяются также две большие группы  пивных дрожжей, «Пиво 1» и «Пиво 2».

1. Доместикация промышленных дрожжей

Спиртовые штаммы не образуют особой группы и разбежались по всему древу. Очевидно, они возникли в результате отбора, которым занимаются различные компании, продающие дрожжи для производства спирта. Кроме того, спиртовые дрожжи, в отличие от пивных или пекарских, повторно не используют, так что у них было меньше возможностей образовать особую группу.
Своим разнообразием промышленные штаммы отчасти обязаны географическим различиям. Большинство дрожжей для саке родом из Азии, у них один общий предок, и они в родстве с дикими и биоэтанольными штаммами из Китая. А североамериканские дрожжи для производства этанола родственны тем, которые используют в Бразилии для получения спирта из сахарного тростника. Клада «Пиво 1» распадается на три подгруппы: штаммы континентальной Европы (Бельгии и Германии), Великобритании и Соединенных Штатов. Пивные дрожжи Северной Америки, в отличие от биоэтанольных, явно произошли от британских штаммов, а не от местных. Клада «Пиво 1» рано обособилась от других групп и развивалась независимо. Клада «Пиво 2» возникла позже и связана с винными дрожжами, в нее входит пятая часть всех винных штаммов. Она объединяет дрожжи из Бельгии, Великобритании, Соединенных Штатов, Германии и Восточной Европы, но четкого географического подразделения внутри нее нет. Наличие двух больших, генетически различных источников пивных дрожжей говорит о том, что их одомашнивание происходило в Европе, дважды и независимо, причем одно из этих событий дало начало как винным, так и пивным дрожжам («Пиво 2»).
На каждой пивоварне для  производства разных сортов пива обычно используют  один и тот же штамм, поэтому дальнейшего дробления внутри пивных клад не произошло. Исключение составляют дрожжи для производства нескольких местных сортов пива, таких, как бельгийский сайзон и британский стаут.


Пивные — домашние, винные — уличные

Оценивая фенотипические признаки дрожжей, исследователи обнаружили несомненное влияние доместикации. Сильнее всего оно проявилось у пивных штаммов, и связано это со спецификой пивоварения.
Пиво варят круглый год, причем старую пивную гущу с дрожжами не выбрасывают, а используют для сбраживания новой порции. Таким образом, пивные дрожжи долгое время и без перерывов находились в стабильной и сытной среде. Ученые подсчитали, что со времени начала отбора прошло не менее 75 тысяч дрожжевых поколений. Оказавшись в новых условиях, пивные дрожжи за ненадобностью утратили многие признаки, необходимые для выживания в суровой естественной среде. Прежде всего, значительная часть пивных штаммов полностью распрощалась с половым размножением. 
В природных условиях S. cerevisiae размножаются как бесполым путем, так и половым. В благоприятной обстановке они почкуются: на рисунке в начале статьи видны круглые шрамики, оставленные отпочковавшимися дочерними клетками. В стрессовой ситуации (холод, голод или недостаток влаги) дрожжи переключаются на половое размножение и образуют споры, которые позволяют пережить тяжелый период. В пивоварне, где дрожжи всегда при деле, они прекрасно обходятся без полового размножения, более половины штаммов «Пива 1» только почкуются, у остальных споры часто нежизнеспособны. Такая особенность в других промышленных кладах редка (не более 21%), а у диких дрожжей не встречается вовсе.
Спиртовые и винные штаммы не могут себе позволить отказаться от полового размножения. Чистые дрожжевые культуры виноделы стали использовать только с начала ХХ века, до этого они несколько тысяч лет обходились природными дрожжами. Винные дрожжи растут только в вине, а сезон виноделия короток. Значительную часть года они проводят на виноградниках и в кишечнике насекомых. Во время этих голодных периодов винные дрожжи почти не почкуются, но могут размножаться половым путем и даже скрещиваться с дикими дрожжами. Более того, лишь небольшая часть винных дрожжей в следующем сезоне вновь попадет в виноградное сусло, в то время как в пивоварении этот путь открыт триллионам клеток. Нет, такая жизнь явно не позволяет ограничиться почкованием. В результате на винных дрожжах влияние человека сказывается значительно слабее, чем на пивных.  Благодаря половому размножению и скрещиванию с дикими видами, а также и непродолжительному пребыванию в антропогенной винной среде они эволюционируют гораздо медленнее пивных.

Спирты, сахара и аромат гвоздики

Люди не задумывались над тем, могут ли дрожжи образовывать споры. Вот чтобы они быстро росли — это важно. (Размножение почкованием, конечно, быстрее полового.) А еще люди хотят получать вкусный, хорошо усваиваемый, долго хранящийся и успокаивающий благодаря присутствию этанола продукт. Прежде всего от дрожжей требуется синтезировать этиловый спирт, и в результате отбора они научились производить его в больших количествах и существовать в достаточно концентрированном спиртовом растворе. Пивные штаммы производят 7,5—10 объемных процентов этанола, а дрожжи, используемые для приготовления более крепких напитков — саке, спирта, вина и в особенности биоэтанола, могут производить 14,5%-ный раствор. В природе таких условий нет, и эти качества не требуются.
Спирт образуется в результате расщепления сахаров, и дрожжи должны их активно усваивать. Пивные штаммы явно прошли отбор на интенсивное расщепление мальтотриозы, одного из основных сахаров пивного сусла (рис. 2). Эта способность зависит от специфического аллеля AGT1 гена MAL11, который присутствует только в дрожжах «Пива 1» и некоторых штаммах смешанной клады. У винных дрожжей ген MAL11 и даже локус MAL1  полностью отсутствует.

2. Пивные дрожжи должны активно расщеплять мальтотриозу и не синтезировать 4-винилгваякол

Помимо спирта, дрожжи синтезируют разные вещества, придающие продуктам приятный запах и вкус. Но некоторые ароматы, пусть и самые приятные, не всегда уместны. Одно из ароматических веществ, 4-винил гваякол (4-ВГ), пахнет гвоздикой, и этот запах нежелателен в саке и большинстве видов пива и вина.  Синтез 4-ВГ контролируют два гена: декарбоксилаза фенилакриловой кислоты PAD1 и декарбоксилаза феруловой кислоты FDC1. Оба располагаются рядышком в IV хромосоме и помогают обезвреживать токсичную фенилакриловую кислоту, которая встречается в стенках растительных клеток. Так что в природных условиях активность этих генов жизненно необходима, но большинство промышленных штаммов, особенно пивные и саке, утратило способность синтезировать 4-ВГ. Исследователи обнаружили в их геноме мутации, нарушающие функции PAD1 и FDC1. Более того, разные сублинии несут разные мутации, которые независимо возникали в ответ на отбор против синтеза 4-ВГ. Анализ генома показал, что мутации в обоих генах произошли очень рано, в самом начале расхождения S. cerevisiae  и родственного вида S. paradoxus от общего предка. Пекарские и биоэтанольные дрожжи сохранили гены PAD1 и FDC1 в целости: в этих производствах 4-ВГ не помеха. Запах 4-ВГ исчезает в процессе выпечки, а биоэтанол не предназначен для внутреннего употребления, и аромат гвоздики никого не беспокоит.
Некоторые любители пива ценят пряный аромат. Нефильтрованное пшеничное пиво хефевайцен традиционно пахнет гвоздикой и содержит значительное количество 4-ВГ.  Дрожжи хефевайцена входят в кладу «Пиво 1», но они мозаики, геном этого штамма собран из фрагментов представителей всех трех субклад, в основном бельгийско-германской. Небольшую часть генома они получили  от винных дрожжей, однако именно эта часть содержит функциональные гены PAD1 и FDC1. Ученые полагают, что дрожжи хефевайцена возникли в результате скрещивания между разными пивными и винными штаммами — получился гибрид, сочетающий типичную для пивных дрожжей способность ферментировать мальтотриозу и гены синтеза 4-ВГ.
В геномах промышленных штаммов ученые обнаружили все нарушения, свойственные одомашненным видам: полиплоидию и нехватку хромосом, перестройки, делеции и дупликации, изменения копийности генов. Например, многие гены, вовлеченные в переработку мальтотриозы, амплифицированы у пивных и саке-дрожжей, но зачастую потеряны у винных. Однако копийность генов, ответственных за базовый метаболизм углерода и азота, транспорт ионов и флокуляцию (способность дрожжей по окончании ферментации собираться в комочки и оседать на дно емкости, где происходило брожение), сохранилась.


Одомашнивание до открытия

Итак, дрожжи обладают всеми специфическими чертами доместицированного организма: расстроенным геномом, хозяйственно-ценными признаками, адаптацией к жизни в антропогенной среде и утратой полового размножения (рис. 1). Их разнообразие и отличительные признаки вызваны в большей степени одомашниванием, чем географической изоляцией. Вопрос в том, когда это одомашнивание произошло.
Люди варили пиво уже за три тысячи лет до нашей эры. Они делали вино и пекли хлеб, используя для брожения природные дрожжи, старую закваску или пивной осадок, но о существовании дрожжей не догадывались. В 1680 году дрожжи наконец разглядел и зарисовал Антони ван Левенгук. В 1837 году их увидал французский ученый Каньяр де ля Тур и понял, что перед ним живые организмы и пиво создают именно они. Его гипотеза получила подтверждение только 1857 году, когда Луи Пастер доказал микробиологическую природу спиртового брожения. До этого брожение считали химической реакцией. В 1881 году датский микробиолог Эмиль Хансен, сотрудник фирмы «Карлсберг», впервые получил чистую культуру пивных дрожжей, что позволило заметно улучшить качество напитка. Эту культуру назвали Saccharomyces сarlsbergensis. Только тогда пивовары, виноделы и пекари узнали, с чем они имеют дело, и смогли приступить к сознательному отбору. Однако анализ генома показал, что одомашнивание дрожжей началось много раньше (см. рис. 1).
Исследователи учли, что американские пивные штаммы произошли от британских, а британские колонисты появились в Америке в начале XVII века. Пивные дрожжи размножаются только почкованием и делятся примерно трижды в неделю, следовательно, за год сменяется примерно 150 поколений. Подсчитав частоту мутаций, ученые определили, что расхождение между субкладами «Пива 1» произошло примерно в 1573—1604 годах. Интересно, что в те же годы домашнее пивоварение постепенно сменяется централизованным. Пиво стали делать при пабах, в монастырях, а затем на больших пивоварнях. Там пиво варили не как дома, от случая к случаю, а непрерывно. Кроме того, профессиональные пивовары должны были обращать особое внимание на качество своей продукции. Все это создало условия для неосознанного пока отбора, то есть доместикации,  дрожжей. Заметную роль в одомашнивании сыграла изоляция — появились линии дрожжей, которые постоянно росли в созданных человеком средах, утратив связь с внешним миром. Субклада «Пиво 2» образовалась позже, в 1645 — 1671 годах, но все равно задолго до работ Пастера и Хансена.
Трудно подсчитать, сколько разных штаммов и в каком контексте было одомашнено, ограниченное количество клад промышленных дрожжей и их четкое отличие от диких родственников позволяет предположить, что современные промышленные дрожжи произошли от небольшого числа предковых штаммов или от их близкородственных групп.
Теперь, когда люди знают не только о существовании дрожжей, но и о функциях, который выполняют различные их гены, и об особенностях геномов разных штаммов, у специалистов  есть возможности продолжать отбор «с открытыми глазами» и получать новые промышленные дрожжи невиданного прежде качества.