Химическая борьба

Отгремели олимпийские баталии-2008, и пришло время анализировать успехи. Самая главная новость — победа сборной Китая, которая набрала на 30% больше золотых медалей, чем ближайший соперник — сборная США, и в два раза больше, чем занявшая третье место сборная России. Злые языки сразу же начали говорить, что причина не только в высоких стандартах КНР по подготовке спортсменов с ранней юности, но и в успехах китайских фармацевтов, которые сумели обмануть антидопинговый контроль. А как раз накануне Олимпиады в «European Journal of Mass Spectrometry» европейские специалисты поделились мыслями о том, как следует совершенствовать методики анализов. На основании их статей составить системное представление о проблеме вряд ли возможно, а вот заглянуть в лабораторию, которая занимается антидопинговым контролем, — вполне. Что мы и сделаем.

Работа с хроматографом

Сорок лет назад международное сообщество начало борьбу с маленькими спортивными хитростями, благодаря которым победу в соревнованиях может одержать не самый сильный или умелый, а самый хитрый; тот, кто додумался посоветоваться с врачом и принять препарат, увеличивающий силу, ловкость или выносливость. Другими словами, возник антидопинговый контроль. Как положено по законам диалектики, с тех пор не прекращалось соревнование между методами нападения — поиском все новых препаратов, которыми можно воспользоваться на законных основаниях либо тайком, и методами защиты совершенствованием способов обнаружения этих препаратов.

Каждый год Мировое антидопинговое агентство обновляет список запрещенных препаратов. Когда мы в прошлый раз писали о допингах (см. «Химию и жизнь», 2001, № 12), он состоял из пяти основных групп. Сейчас в него входят девять групп веществ (анаболики, гормоны и вещества аналогичного действия, бета-2-агонисты, антагонисты и модуляторы гормонов, мочегонные и другие маскирующие средства, стимуляторы, наркотики, каннабиноиды, глюкокортикостероиды) и три метода (улучшение обмена кислорода, химические или физические воздействия, а также генетический допинг, под которым понимают гипотетическое применение стволовых клеток). Кроме того, в отдельных видах спорта запрещено потребление бета-блокаторов, которые оптимизируют работу сердца, и алкоголя. Итого более двух сотен веществ, различающихся фармакологически и химически, а лекарственных препаратов, в состав которых входят эти вещества, — тысячи. Контрольная лаборатория должна уметь находить следы всех этих веществ и продуктов их превращения в организме человека. Наиболее распространенный способ — одновременное выявление их следов в пробе мочи. Если результаты вызовут подозрения, то проводят более тщательный анализ. Причем времени на это совсем немного, ведь запрещенные вещества могут быстро исчезать из организма без следа или оставляя такие следы, которые невозможно отделить от веществ естественного происхождения. А спортсменов много. Поэтому перед химиками стоит нетривиальная задача — поиск мельчайших концентраций множества веществ одновременно ив сотнях проб. Следовательно, метод должен основываться на оборудовании и реактивах, которые нетрудно обеспечить в нужном количестве, и за один раз определять если не все вещества из запретного списка, то хотя бы принадлежащие к одной крупной группе.

Чтобы это сделать, применяют хроматограф и масс-спектрометр. Надо сказать, что хроматография, гениальное изобретение русского ученого М. Цвета, в настоящее время представляет собой самый распространенный, хотя и далеко не единственный, метод разделения соединений. Соответственно хроматографы, газовые и жидкостные, наиболее часто и эффективно используются в химическом анализе. Сейчас они работают в паре с различными методами определения поочередно выходящих из колонки веществ. В области, которая обсуждается в этой статье, наиболее успешно используют комбайны — хроматомасспектрометры или, как их сокращенно называют, хромасы. Приборы в этой паре работают следующим образом. Хроматограф разделяет смесь веществ и они выходят из хроматографической колонки не одновременно, а по очереди. По мере выхода их ионизируют и молекулы искомого вещества, если они содержатся в пробе, частично разрушаются, а частично претерпевают внутримолекулярные перегруппировки. Эти продукты ионизации и определяют с помощью масс-спектрометра. Анализируя известные вещества, аналитики получают тот эталон, благодаря которому искомое вещество можно потом найти в смеси сложного состава.

Довольно долго в контролирующих лабораториях применяли газовую хроматографию, при которой проба поступает в колонку с потоком газа. К сожалению, определяемое вещество необходимо перевести в газовую фазу, а многие интересные в данном случае соединения не выдерживают довольно высокой температуры газовой среды. Иногда положение можно исправить — изменить функциональные группы определяемого соединения, или, как говорят аналитики, дериватизировать соединение, чтобы получить такое производное, которое устойчиво в высокотемпературном потоке газа. Кроме того, чтобы близкие по составу вещества хорошо отделились друг от друга, к ним тоже бывает полезно добавить какие-то функциональные группы. Поскольку к разным веществам нужно присоединять разные группы, это накладывает ограничение на список компонентов, которые можно определить в одной пробе. Чтобы ускорить процесс, надо взять колонку покороче, а давление газа увеличить. Однако в результате время, разделяющее выход разных веществ, уменьшается, а это может снизить точность анализа.

Другой способ — жидкостная хроматография, когда сквозь колонку проходит жидкость. Ее главное преимущество — специально преобразовывать анализируемые вещества как правило не нужно, поэтому число компонентов, которые удается одновременно найти в пробе, резко возрастает. Так что когда удалось масс-спектрометр соединить в одно целое с жидкостным, а не газовым хроматографом, ситуация принципиально изменилась ­ разумеется, к лучшему, и метод стал мощным оружием в руках борцов с допингом. Особенно если применять тандемную масс-спектрометрию, в которой один спектрометр проводит дальнейшее разделение веществ, а второй их анализирует.

Недавно же появился метод сверхбыстрой жидкостной хроматографии: в колонки засыпают мелкие, диаметром менее 2 мкм, частицы сорбента, а вся система оптимизирована для работы под высоким давлением и с малыми объемами пробы. Именно этот метод испанские ученые из барселонских Госпиталя дель Мар и Университета Помпеу Фабра считают наиболее перспективным. Чтобы обосновать свою точку зрения, они выбрали 33 вещества, которые входят в черный список. Большинство их принадлежало к числу мочегонных, но были и стимуляторы, и маскирующие вещества, и вещество, улучшающее кислородный обмен, и метаболиты бета-блокаторов. Все эти соединения добавили в чистую мочу, а потом за рекордные пять минут все их нашли в пробе и определили концентрации.

Манипуляции с водой

Изобретательности спортивных врачей в использовании лекарств не по назначению можно подивиться. Вот, к примеру, многочисленные мочегонные средства, казалось бы, совершенно безобидные вещества. Как они могут способствовать получению высоких спортивных результатов? Двумя путями. Первый: сократить на время вес борца, боксера, штангиста. Спортсмен, чей вес из-за потери жидкости уменьшится, попадет в другую весовую категорию, а сила-то у него останется прежней.

Второй путь более хитрый. Возьмем стимулятор, который либо сам по себе вырабатывается в организме человека, либо продукты его распада не отличишь от образующихся естественным путем. Очевидно, что его концентрация в моче или крови в любом случае не будет равна нулю. Если принять такой запрещенный препарат, а потом добавить мочегонное, то количество вышедшей из организма жидкости увеличится, а концентрация вещества в ней соответственно уменьшится. Неудивительно, что принимать мочегонные препараты спортсменам во время соревнований запрещено. Однако, не всякое мочегонное может быть принято спортсменом злонамеренно.

Вот, например, маннит ­ один из тройки широко известных сахарозаменителей, среди которых есть еще ксилит и сорбит. По строению эти вещества родственники, многоатомные спирты, которые можно получить, соответственно, из сахарозы, ксилозы и глюкозы. Но D-маннит, в отличие от сорбита, еще и диуретик. Поэтому в медицине его часто используют как мочегонное, для того, например, чтобы снижать давление. Ближайший родственник маннита, да что там, вообще его стереоизомер — сорбит, еще более сладкий сахарозаменитель: молекулы этих веществ различаются друг от друга взаимным расположением в пространстве гидроксильных групп. Как же химикам в лаборатории отличить спортсмена, которому сделали запрещенный укол с маннитом, от того, кто выпил чаю или газировки с сорбитом?

Вот как предлагают решать эту задачу ученые из кельнского Германского спортивного университета. Они выбрали газовую хроматографию и масс-спектрометрию. Для успеха предприятия все ОН-группы заменили на более тяжелые ацетильные. Это помогло разделению изомеров в колонке: время между соответствующими пиками на хроматограмме составило около трех секунд. Затем они отобрали группу добровольцев, которых стали поить водой с маннитом и сорбитом, давая по пятьдесят граммов этих веществ в день, и смотрели, как это скажется на составе мочи. Оказалось, что маннит в организме никак не изменяется и почти весь выводится за три часа после приема, хотя и через восемь часов его концентрация все еще составляет 200 мкг/мл. А вот сорбит ведет себя совсем по-другому. Значительная его часть в организме претерпевает изменения, и уже спустя 4-6 часов его концентрация в моче падает почти до нуля. Результаты исследования мочи людей, которым специально маннит не давали, показали, что средняя его концентрация равна 55-250 мкг/л. Обычно же для получения необходимого спортсмену эффекта нужна доза в 50-100 г маннита, что повысит его концентрацию в моче до 25-50 мг/л. Вот так благодаря количественному анализу можно уличить недобросовестного спортсмена, даже если он будет рассказывать, что накануне злоупотребил газировкой с сорбитом.

Глицерин, наоборот, способствует сохранению жидкости в организме. И это его качество тоже можно использовать для улучшения спортивных результатов, особенно в тех видах, которые связаны с длительными нагрузками — велосипедными гонками или триатлоном. Как показали эксперименты, там, где требуется еще и быстрота реакции, скажем, в теннисе, использование глицерина для снижения потерь воды никакого эффекта не дает. Однако глицерин образуется в процессе обмена веществ, а именно превращения жиров, и поэтому всегда присутствует в плазме крови, особенно у спортсменов, выполняющих силовые упражнения. Кроме того, глицерин входит в состав лекарств, которые применяют для лечения глаукомы или понижения внутричерепного давления. Как же отличить законный глицерин от запретного?

Чтобы определить, что есть глицериновая норма, а что — ее превышение, ученые из того же университета обработали 1039 анализов мочи спортсменов самых разных дисциплин, причем анализы были взяты как во время соревнований, так и вне них. Оказалось, что вопреки распространенному мнению, согласно которому у здорового человека глицерина в моче нет, содержание этого вещества во всех пробах отнюдь не стремилось к нулю. Обычно оно было менее 20 мкг/л (а порог определения при использовании газовой хроматографии и масс-спектрометрии равен 0,9 мкг/л), однако в некоторых случаях доходило почти до 200 мкг/л. Более того, содержание глицерина варьировало в зависимости от вида спорта: у одних спортсменов повышенное содержание глицерина наблюдалось во время соревнований, у других — в состоянии покоя. Все эти нюансы нужно учитывать при обработке антидопинговых проб. В целом ученые пришли к выводу, что пределом содержания глицерина в моче следует признать 200 мкг/л. Поэтому проба, в которой в 2007 году намерили 2690 мкг/л, несомненно свидетельствует о незаконном применении глицерина.

Болезнь — залог победы

Есть такая околоспортивная шутка: эх, нам бы спортсмена, у которого побольше болезней, мы б из него сделали чемпиона! Например, очень хорош лыжник, страдающий астмой. Почему? А потому что в 40-е годы прошлого века был придуман противоастматический препарат метоксифенамин. И сам он, и особенно один из продуктов его метаболизма весьма схожи по химическому строению с известным стимулятором амфетамином, кроме того, метоксифенамин принадлежит к числу бета-агонистов. (Такие вещества взаимодействуют с бета-блокаторами — в норме их активируют адреналин и норадреналин.) Поэтому спортсменам запрещено его принимать, а лыжнику-астматику можно прописать другое лекарство, на которое антидопинговый комитет еще не обратил внимание. Однако искать этот метоксифенамин в моче непросто, потому что у него есть несколько изомеров, в том числе обладающих наркотическим действием. Как же химики различают такие вещества?

Несмотря на то, что злоупотребления метоксифенамином случаются редко — всего два раза за четыре года, прошедшие с Олимпиады-2004, — такая проблема имеется, и в очередной раз она возникла в начале 2008 года, когда немецким ученым показались подозрительными результаты анализа, выполненного методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии. Выяснять подробности они стали, применив жидкостную хроматографию с тандемным масс-спектральным анализом, о которой шла речь в начале статьи. В данном случае ее дополнительным преимуществом была возможность использовать непосредственно анализируемую мочу, что позволило обойтись без потерь и так небольшого количества материала.

Как оказалось, жидкостная хроматография легко разделяет изомеры этого соединения — время между пиками на хроматограмме составило почти целую минуту. А масс-спектрометр дает немного различающуюся высоту пиков. При повторном анализе подозрительной пробы оказалось, что искомое вещество проходит сквозь колонку за то же время, что и метоксифенамин, и пики на масс-спектрограмме соответствуют именно ему, а не какому-то изомеру. Так было подтверждено использование допинга.

Разложение гормона

Однако самые большие трудности связаны с анаболиками, которые способствуют быстрому росту мышц и восстановлению сил после физических нагрузок. Медики применяют эти препараты для лечения ослабленных болезнью пациентов, а также назначают при остеопорозе. Некоторые культуристы используют их (не задумываясь о печальных последствиях) для получения хорошей фигуры. Ну а спортсмены — для победы на соревнованиях.

До недавнего времени в поле зрения антидопингового комитета попадали главным образом стероидные гормоны андрогены, аналоги мужского полового гормона тестостерона. Приготовляя препараты на его основе, фармацевты стараются улучшить действие этого гормона на мышцы, при этом сведя к минимуму специфические эффекты, связанные с полом, а также разрушительное влияние на печень и сердце. Ныне известно несколько сотен легальных аналогов тестостерона, не считая продукции нелегальных лабораторий и веществ, специально приготовленных для обмана проверяющих органов. Определять андрогены в пробе сложно еще и потому, что эти гормоны полностью преобразуются в организме и, как правило, в моче удается найти только продукты их превращения. Поэтому нужно заранее знать, что следует искать.

Кроме того, совсем недавно, в 1998 году, появились нестероидные модуляторы андрогенных рецепторов. Из-за отсутствия стероидной компоненты они не обладают некоторыми побочными действиями своих предшественников и поэтому считаются весьма перспективными. Более того, можно приготовить вещество, которое будет активировать или тормозить андрогенные рецепторы только у клеток определенной ткани. Множество таких препаратов еще не прошли клинических испытаний и потому как будто не существуют. Недобросовестные же спортсмены вполне могут их использовать. Неудивительно, что в качестве превентивной меры нестероидные андрогенные модуляторы в январе 2008 года подпали под запрет.

Не только мужские половые гормоны, но и женские тоже находят свое место в спорте. Примером служат модуляторы эстрогенного рецептора. Фармацевты их придумали для борьбы с раком груди, остеопорозом и сердечно-сосудистыми заболеваниями. Однако мужчины, которые принимали слишком большие дозы андрогенных анаболиков, подавляют в своем организме естественный синтез андрогенов, и это можно заметить. Прием же эстрогенов помогает этот недостаток компенсировать, поэтому в 2000 году эти препараты подпали под запрет для спортсменов-мужчин. К сожалению, и в этом случае отнюдь не всегда известен список метаболитов, которые нужно искать в моче спортсмена.

Чтобы решить эту проблему, сотрудники антидопинговых лабораторий заранее готовятся к анализу соединений, строения которых они еще не знают. Сложность еще и в том, что о препарате, не прошедшем клинических испытаний, нет никакой возможности узнать, на какие составляющие он разлагается в организме. В самом деле, нельзя же кормить спортсменов-добровольцев веществом, безопасность которого не доказана. Приходится работать на моделях, то есть либо использовать животных (дорого, но надежно), либо проводить реакции в пробирке (дешево, но менее надежно).

Один из перспективных способов — электрохимический. С его помощью можно промоделировать окисление веществ, происходящее в организме под действием цитохрома Р450. Пропуская раствор с препаратом через ячейку с двумя электродами и меняя время от времени потенциал между ними, удается из синтезированного препарата получить вполне достаточный набор метаболитов для последующего анализа. Другой способ — промоделировать превращения стероидных гормонов в организме с помощью изолированных ферментов печени. Как показывает сравнение с данными реальных анализов, набор метаболитов получается вполне приемлемым.

Естественно, коль скоро основой для этой статьи послужил номер журнала по спектрометрии, то этим методом и пользовались все авторы работ для поиска запретных веществ. Подобный метод — не единственный в арсенале контрольных лабораторий. Однако именно масс-спектрометрия в различных вариантах — одно из наиболее быстро развивающихся направлений химического анализа. Сейчас сочетанием хроматографии и масс-спектрометрии удается надежно обнаружить более 600 запрещенных препаратов. Более изощренные методики, включающие изотопный анализ или масс-спектрометрию высокого разрешения/высокой точности, дают возможность выявлять неправомочное использование естественно образующихся гормонов вроде тестостерона, а также различных пептидов и белков. В то же время усложнение допинг-контроля требует все новых методик анализа таких классов веществ, как жиры, углеводы, пептиды, белки и многие низко- и высокомолекулярные ксенобиотики. В общем, химики-аналитики с оптимизмом смотрят в будущее: развитие спорта, сочетающееся с прогрессом химии и фармакологии, не оставит их без работы и химическая борьба долго еще останется олимпийским видом спорта.