Просто добавь люциферазы

Чужая клетка — потемки, но рассеять мрак неизвестности поможет биолюминесценция.

Присказка

Многие живые существа светятся в темноте. Светятся они, когда фермент люцифераза катализирует окисление находящегося в клетках вещества люциферина, и окисляемый люциферин испускает кванты видимого света. Это свечение называется биолюминесценцией. Биолюминесценцию широко используют в исследовательских и диагностических целях, мы о ней много писали (см., например, «Химию и жизнь» 2014 №9 «Огоньки под ногами», «Флуоресцентные репортеры и их репортажи») и вновь возвращаемся к этой теме, потому что наука не стоит на месте.

Биолюминесценцию легко увидеть и измерить с большой точностью, и она очень чутко реагирует на состояние окружающей среды, поэтому светящиеся организмы удобно использовать в качестве биосенсоров. Биолюминесценция привлекательна и как маркер генной активности. Если нужно выяснить, в каких частях организма и в какое время работает некий ген, не уничтожая при этом объект исследования, его снабжают светящейся меткой.

Ген начинается с промотора — регуляторной последовательности, которую узнает фермент РНК-полимераза. Это узнавание позволяет считать информацию с последовательности ДНК. Есть промоторы конститутивные, то есть работающие постоянно, и индуцибельные, которые активны только при определенных условиях, например зависят от температуры, времени суток или типа клеток. Если поставить ген люциферазы под контроль того же промотора, что и ген, за работой которого мы хотим проследить, оба будут работать в одинаковых условиях. Остается ввести эту генную конструкцию в клетки растения или животного, потом добавить люциферин (животным — внутривенно или внутрибрюшинно, растениям — в питательную среду) и отмечать, где и когда появляется свечение. Если, к примеру, у трансгенного растения светятся только лепестки, причем по ночам, это значит, что исследуемый ген работает там же и тогда же. А еще геном люциферазы можно пометить опухолевые клетки, которые перевивают лабораторным животным, и потом наблюдать за ростом и распространением опухоли в организме. Биолюминесценция позволяет определять содержание в живых клетках различных веществ, влияющих на свечение, в первую очередь АТФ, некоторых ферментов и ионов.

Как водится, эти превосходные планы, столь простые в теории, воплощаются в жизнь с трудом. Прежде всего, нужно выбрать удобную для работы систему биолюминесценции. Собственным светом сияют микроорганизмы (преимущественно морские), морские же беспозвоночные (медузы, мягкие кораллы Renilla), глубоководные креветки Oplophorus, рачки-копеподы Gaussia, некоторые насекомые, черви и грибы. Хотя принципы биолюминесценции во всех случаях одинаковые, ферменты у этих организмов разные и люциферины тоже (рис. 1). Сейчас известно девять люциферинов и семь семейств люциферазных генов, и в природе существует не менее сорока биолюминесцентных систем. Очень немногие изучены настолько хорошо, чтобы пытаться использовать их в практических целях или создать по их подобию искусственную автономно светящуюся систему. Пожалуй, самая капризная часть системы биолюминесценции — люциферин.

1. У разных организмов разные люциферины. а — флавинмононуклеотид, бактериальный люциферин; б — D-люциферин светлячка; в — варгулин, люциферин рачков Cypridina; г — целентеразин, люциферин мягких кораллов; д — миристиновый альдегид, еще один бактериальный люциферин

Что требуется от люциферина, вводимого в объект исследования? Прежде всего, нетоксичность, это понятно. Он должен испускать световые волны такой длины, чтобы ткани организма их не поглощали. И наконец, люциферин должен хорошо проникать во все ткани организма, иначе непонятно будет, отчего объект не светится: то ли ген люцферазы не работает, то ли люциферина недостает. Возьмем, для примера, D-люциферин светлячка. В воде он растворяется хорошо. После внутрибрюшинной или внутривенной инъекции быстро распространяется в организме животного, проникает даже в мозг и через плаценту и малотоксичен. В растения его можно доставлять, добавляя в воду для полива. Однако в растительных тканях D-люциферин распространяется неравномерно, светится слабо и недолго, да и стоит дорого, до нескольких сотен долларов за грамм. Кроме того, такой способ доставки светящегося вещества не позволяет работать с растениями в открытом грунте, они могут расти только на питательной среде или в горшках.

Вносить люциферин в живые объекты слишком обременительно. Не проще ли заставить организм синтезировать это вещество в собственных клетках? Увы, этот синтез не всегда совместим с метаболизмом хозяина: в клетке должны присутствовать необходимые соединения и ферменты, а сам синтез люциферина не должен мешать другим биохимическим процессам. До недавнего времени был известен лишь один удачный пример. В 2014 году американские и израильские исследователи под руководством Виталия Цитовского, профессора Университета Стоуни-Брук, воспроизвели в растениях табака люциферазный цикл морской бактерии Photobacterium leiognathi.

Бактериальная люцифераза использует в качестве люциферина флавинмононуклеотид (ФМН) и длинноцепочечный миристиновый альдегид, полученный из жирных кислот (рис. 1). Цикл биолюминесценции обеспечивают шесть генов. Два из них, luxA и luxB, кодируют альфа- и бета субъединицы бактериальной люциферазы, luxC, luxD и luxE ответственны за ферменты, необходимые для синтеза альдегида, и luxG — за фермент флавинредуктазу, которая участвует в восстановлении ФМН.

Обеспечить работу бактериальных генов в ядре растительной клетки трудно, поэтому конструкцию из шести генов lux встроили в геном пластид, эволюционно сходных с цианобактериями.

Пластиды — органеллы, в которых происходит фотосинтез. В них образуется рибофлавин — исходное вещество для синтеза ФМН. В них работает фермент, необходимый для биосинтеза жирных кислот — предшественников миристинового альдегида. У исследователей были основания ожидать, что им удастся полностью воспроизвести в пластидах высших растений люциферазный цикл морской бактерии. И у них получилось. Трансгенные растения светились, хотя и слабенько: чтобы заметить свечение, глаз должен был привыкнуть к темноте. Свет голубой, длина волны 490 нм. Ученые рассуждали о том, как можно усилить яркость и повлиять на спектр люминесценции. Однако оптимальным решением было бы найти для растений другую систему биолюминесценции: трансформация пластид технически очень сложна. И такая система нашлась, когда российские ученые расшифровали цикл биолюминесценции грибов.

Цикл кофейной кислоты

Свечение грибов известно с незапамятных времен. Его отмечал еще Аристотель в IV веке до нашей эры. Известно около 100 видов светящихся грибов, они растут на всех континентах. У некоторых видов светятся и мицелий, и плодовые тела, у других — только мицелий. Молодой, активно растущий мицелий светится ярче старого, а молодые плодовые тела — ярче зрелых. Интенсивность люминесценции зависит от вида гриба и внешних условий.

Не вполне ясно, зачем они светятся. Морские и наземные животные привлекают своим сиянием половых партнеров, подманивают добычу или отпугивают хищников. Грибам эти причины явно не подходят. Американские биохимики Уильям Макэлрой и Бернард Стрелер еще в середине прошлого века предположили, что свечение защищает живые организмы от повреждения активными формами кислорода (АФК). В 2014 году специалисты Института биофизики Красноярского отделения СО РАН, изучавшие грибную биолюминесценцию, проверили эту гипотезу на грибах. Кусочки мицелия светящегося гриба Neonothopanus nambi тщательно отмывали от питательной среды и облучали на рентгеновской установке. При длительном облучении интенсивность люминесценции гриба в течение нескольких часов медленно нарастала и достигала максимума, превышающего исходный уровень свечения в пять–семь раз. Потом люминесценция медленно затухала, вне зависимости от того, продолжалось облучение или нет, после чего гриб полностью утрачивал способность светиться. При кратковременных сеансах облучения уровень люминесценции мицелия каждый раз повышался незначительно, однако гриб способности к свечению не терял. Под действием облучения в воде, окружающей мицелий и содержащейся в нем, может образоваться большое количество АФК. Ученые предположили, что грибной люциферин использует часть молекул для окисления, тем самым нейтрализуя АФК. При длительном облучении мицелия содержание АФК в грибе может увеличиться настолько, что упомянутые системы защиты не справятся с их нейтрализацией. Тогда ферментные комплексы, обеспечивающие люминесценцию, окисляются и гриб необратимо теряет способность светиться.

А бразильские ученые полагают, что биолюминесценция привлекает насекомых, разносящих споры. Грибы растут под пологом леса, где ветер дует слабо, и помощь в распространении спор очень кстати. Исследователи изготовили из акрила искусственные грибы, которые освещали изнутри зеленым светодиодом. Ночью на светящиеся ловушки налезло намного больше насекомых (жуков, клопов, мух, муравьев и ос), чем на темные.

Вопрос о биологическом смысле грибной люминесценции, безусловно, интересен, однако с практической точки зрения важнее знать, как они светятся. Это стало известно в декабре 2018 года, когда в «Proceedings of the National Academy of Sciences» вышла статья с расшифровкой механизма биолюминесценции грибов. Помимо российских ученых, в этой работе участвовали коллеги из Австрии, Великобритании, Испании, Бразилии и Японии. Но основную часть исследования выполнили специалисты Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова и Института биофизики Красноярского научного центра СО РАН. Руководили исследованиями Илья Ямпольский и Карен Саркисян.

В качестве объекта исследования ученые использовали уже знакомый нам N. nambi — древесный гриб из тропических лесов Южного Вьетнама. Гриб довольно неказистый, но в темноте он светится ярким изумрудным светом.

Механизм грибной люминесценции показан на схеме (рис. 2). Кофейная кислота в два этапа с помощью ферментов гиспидин-синтазы (HispS) и гиспидин-3-гидроксилазы (H3H) превращается в гидроксигиспидин — грибной люциферин. А когда в дело вступают люцифераза и молекулярный кислород, люциферин преобразуется в высокоэнергетическое соединение эндопероксид, при разложении которого получается оксилюциферин (кофеилпируват) и излучается свет. Еще один фермент, кофеилпируватгидролаза (CPH), замыкает цикл, превращая оксилюциферин в кофейную кислоту (рис. 2).

2. Кофейная кислота — универсальное вещество. Растения синтезируют из нее лигнины, флавоноиды и некоторые другие соединения, грибы Neonothopanus nambi — люциферазу. HispS — гиспидин-синтаза; H3H — гиспидин-3-гидроксилаза; Luz — люцифераза; CPH — кафеоил пируват-гидролаза 9

Сравнив геномы многих видов грибов, исследователи пришли к выводу, что грибная биолюминесценция в ходе эволюции возникла только раз, у всех светящихся грибов был общий предок.

Грибная система биолюминесценции как будто специально создана для того, чтобы служить биомаркером в растениях. Она проста, кофейная кислота превращается в люциферин всего в два этапа. Ни один из компонентов цикла кофейной кислоты не токсичен для клеток растений, а главное, кофейная кислота, в большом количестве присутствует в растениях. Она участница фенилпропаноидного метаболического пути, в результате которого образуются лигнин, флавоноиды, антоцианы, кумарины и многие другие классы фенольных соединений, необходимых сосудистым растениям (рис. 2). Пик световой эмиссии 530 нм очень удачно попадает между двумя пиками поглощения растительной ткани и должен быть хорошо заметен.

Иными словами, грибной цикл кофейной кислоты великолепно вписывается в растительный метаболизм, и российские ученые его туда встроили. Результаты своей работы они опубликовали в журнале «Nature Biotechnology» весной 2020 года.

Растения засветились

Для внедрения в растительный геном исследователи создали специальную конструкцию, содержащую гены четырех грибных ферментов цикла кофейной кислоты: Luz, HispS, H3H и CPH. Кофейная кислота в растениях своя, АТФ — тоже.

Получившиеся в итоге трансгенные растения табака росли прекрасно, они даже были на 12% выше диких сородичей, но в остальном (содержание пигментов, время цветения и всхожесть семян) от них не отличались. Это значит, что цикл кофейной кислоты для растений не токсичен.

На всех стадиях развития свечение трансгенного табака было заметно невооруженным глазом, и его можно было заснять даже камерой смартфона, время экспозиции которой не превышает 30 секунд. Интенсивность свечения достигала 10 миллиардов фотонов в минуту и примерно в десять раз превышала яркость свечения при бактериальной системе биолюминесценции.

Интенсивность свечения зависит от доступности кофейной кислоты. А кофейная кислота участвует в синтезе фенилпропаноидов, и потому интенсивность свечения служит показателем метаболической активности. В растениях яркими пятнами сверкают активно растущие участки: кончики семядолей и корней в прорастающих семенах; зона между корнем и стеблем и точки ветвления корней в растущих растениях, причем свечение часто усиливается за несколько часов до того, как ветвление становится заметным; концевые и пазушные почки; ярче всего светятся цветки (рис. 3). В стареющих листьях содержание кофейной кислоты снижается и свечение ослабевает. Тем не менее некоторые листья на последних стадиях старения вспыхивали прощальным светом, возможно, в результате перераспределения питательных веществ.

3. У трансгенных растений табака светятся проростки (а), листья (б) и цветки (в), корни, особенно в точках ветвления (г), тычинки и пестики (д)

Синтез фенилпропаноидов усиливается, если растение повреждено, и листья ярко светились там, где от них отрезали кусочек. При травмах и стрессах в тканях растений увеличивается содержание гормонов метилжасмоната и этилена. Если опрыскать трансгенный табак раствором метилжасмоната или подержать в закрытой банке вместе с банановой кожурой, которая выделяет этилен, растение ярко светится все целиком.

Итак, биолюминесценция позволяет судить о процессах, происходящих в растении: развитии, повреждениях и стрессах. Она даст возможность исследовать растения в открытом грунте, поскольку они светятся автономно, не требуя добавления люциферина. Исследователи даже предположили, что светящиеся растения пригодятся для озеленения зданий и городов. Только для этого придется еще поработать, поскольку в экспериментах биолюминесценция по ночам слабела, а усиливалась после восхода солнца.

Цикл кофейной кислоты можно использовать и для исследований на животных. Ученые вводили мышам клетки карциномы со встроенными генами люциферазы гриба или светлячка (для сравнения), а затем делали животным внутрибрюшинную инъекцию смеси люциферинов гриба и светлячка. Раковые клетки в таких условиях светились практически с одинаковой интенсивностью. Кстати, два эти люциферина, окисляясь, испускают волны разной длины: светлячковая — 550–575 нм, а грибная — 525–530 нм,

поэтому при необходимости можно задействовать одновременно обе метки. Животные и сами могут синтезировать кофейную кислоту, если дополнительно ввести им гены двух ферментов: тирозин аммиак-лиазы и кумарин-3-гидроксилазы. Эти ферменты обеспечивают биосинтез кофейной кислоты из тирозина, а тирозина в животных клетках достаточно. Возможность автономной биолюминесценции ученые продемонстрировали пока на культуре человеческих эмбриональных клеток почки. Исследования на животных впереди.

Кому принадлежат факты и идеи, опубликованные в открытой печати: авторам или всем, кто сумел их оценить? Российская статья о цикле кофейной кислоты возбудила исследователей из университета Миннесоты, и они кинулись встраивать систему грибной биолюминесценции в растения табака. Свои результаты они опубликовали почти одновременно с россиянами в журнале «eLife».

Американская генная конструкция сложнее российской. Помимо четырех ферментов кофейного цикла в нее вошел ген фермента 4’-фосфопантетенилтрансферазы, необходимой для модификации HispS. Российские ученые этого делать не стали, поскольку этот фермент в растениях и так присутствует. Кроме того, американцы решили усилить синтез кофейной кислоты в табаке и добавили к своей конструкции гены двух бактериальных ферментов, которые обеспечивают синтез кофейной кислоты из тирозина. Сигнал действительно получился более сильным, но сравнивать эти результаты с российскими нельзя, поскольку американцы измеряли свечение не в фотонах, а в относительных единицах.

Помимо табака ученые из Миннесоты ввели свою конструкцию в классическое модельное растение арабидопсис, георгины и томаты, барвинок розовый, петунию и три сорта красного шиповника. Все растения светятся, и, что немаловажно, у цветков светятся лепестки, следовательно, биолюминесценция может, теоретически, привлекать опылителей. В сорванных цветах сигнал пропадает в течение дня.

Исследователи попробовали применить биолюминесценцию для исследования работы генов и поставили ген люциферазы под контроль промотора гена ODO1 петунии. Помните, что мы говорили о промоторах? До сих пор гены цикла кофейной кислоты находились под контролем конститутивного промотора, который работает во всех частях растения сутки напролет. Поэтому и растение светится практически целиком и всегда. Ген ODO1 регулирует выделение летучих веществ, то есть запах цветка, а петуния пахнет по ночам. Поэтому и промотор ODO1 активен только в цветочных лепестках, преимущественно вечером и ночью. Если ген люциферазы находится под контролем промотора ODO1, он работает в том же режиме, что и «пахучий» ген, — цветок светится исключительно по ночам, и систему можно использовать для изучения пространственно-временного распределения работы генов.

Создали ученые и другую конструкцию, в которой ген люциферазы начинает активно работать при недостатке влаги.

Кофейная кислота в качестве люциферина — исключительно удобное вещество. Благодаря относительно несложным генетическим манипуляциям можно сделать так, что и в растениях, и в животных она будет присутствовать всегда без вреда для хозяина. Остается только добавить ген люциферазы, который будет окислять люциферин и заставит его светиться при определенных условиях. Ученые извлекут из этой системы много пользы, и обычным людям она доставит немало приятных минут. Это здорово, когда растения светятся в темноте или напоминают о том, что их пора полить.

См. также:
Светящаяся петуния (2024 №5)