Свиньи: история с пересадками

Думаем о роли свиней в медицине вспоминаем о трансплантации органов. Дескать, внутреннее строение этих животных весьма похоже на наше. Это действительно так. Вот только в исследованиях свиных органов как объектов для пересадки за последние два десятилетия произошли существенные сдвиги. Время освежить свои представления, а заодно вспомнить, в каких еще областях биомедицины свиньи показали свою профпригодность.

Свиней (Sus scrofa domesticus) одомашнили дважды. Около девяти тысяч лет назад жители древней Анатолии и древнего Китая независимо друг от друга каким-то образом «подружились» с дикими кабанами (Sus scrofa) и стали использовать их в сельском хозяйстве. И не так давно животные, которых изначально рассматривали в основном как источник мяса и сала, превратились в объект биомедицинских исследований, а также в домашних любимцев.

Фото: Андрей Константинов

Польза и сходство

У людей отношение к свиньям особое. Многие религии свиное мясо есть запрещают, и не зря: велика опасность, что в нем таится сразу несколько паразитов, способных заразить людей и тем самым серьезно навредить их здоровью. Но если паразиты у нас общие, стало быть, физиология свиней близка к человеческой. Это заметили довольно давно — и применили в медицине. Первую роговицу глаза человеку пересадили именно от свиньи в 1837 году, а от человека к человеку лишь на 65 лет позднее («Baylor University Medical Center Proceedings», 2012, 25, 1, 49 — 57, PMC3246856). Подобных примеров можно привести много. Это и сердечные клапаны, и вырабатывающие инсулин клетки поджелудочной железы, и альвеолярный отросток (часть верхней челюсти, несущая зубы), и даже кожа для лечения пролапса органов малого таза.

Немаловажно, что свиной гормон поджелудочной железы — инсулин отличается от человеческого всего на одну аминокислоту из нескольких десятков. Поэтому его долгое время — до развития биотехнологий, позволяющих синтезировать человеческий инсулин в бактериях, — применяли для поддержания нормального состояния у больных диабетом I типа. А в 1993 году и вовсе попробовали пересадить клетки поджелудочной железы, вырабатывающие инсулин, от свиньи человеку (научная статья об этом вышла годом позже: «The Lancet», 1994, 344, 8934, 1402—1404, doi:10.1016/S0140-6736(94)90570-3). Через некоторое время после операции в крови реципиентов обнаружили пептид, характерный именно для свиных тканей, то есть часть пересаженных клеток прижилась. Однако значимого клинического эффекта такая трансплантация не принесла.

Но ничего! Главное, что пациенты перенесли пересадку частей органов от животного другого вида и остались живы. Это уже вселяет надежду на то, что полноценная трансплантация органов свиней людям возможна. Надо только полнее изучить возможные препятствия на этом пути и устранить их одно за другим. Впрочем, легко сказать…

Курс на уменьшение

Свиней стандартных размеров трудновато содержать в лаборатории. Они требуют много корма и немало места. Поэтому несколько десятилетий назад для исследовательских нужд стали разводить небольших свиней (см. «Химию и жизнь», 2011, 9). Их назвали минипигами.

Если животное с фермы весит в среднем 350 кг, то миниатюрные свиньи — от 45 до 90 кг, а есть и совсем крошечные, 6—12 кг. Конечно, 90 кг — тоже немало, зато соответствует массе взрослого человека. У таких животных размер внутренних органов, а также соотношение площади поверхности тела к его объему соответствуют нашим. На минипигах моделируют огромное количество заболеваний человека, от нарушений иммунитета, гипертензии и астмы до болезни Альцгеймера и бокового амиотрофического склероза («Toxicologic Pathology», 2016, 44, 3, 299-314, doi:10.1177/0192623315618292 - полный текст). Изучают на них и потенциальную токсичность новых лекарственных препаратов: у минипигов есть ряд критически важных «человеческих» ферментов печени, которых нет у собак и других модельных животных.

Сначала минипиги появились в научных учреждениях США. Благодаря милому внешнему виду, общительности и всеядности они приглянулись любителям домашних животных, и те вскорости начали покупать их у вивариев и содержать в квартирах. Минипигов можно дрессировать, они умные и чистоплотные. Тем не менее не каждому под силу справиться с животным размером с крупную собаку.

Разновидностей минипигов огромное множество. Получены они различными методами: кто-то выведен путем традиционной селекции, кто-то генетически модифицирован так, что его рост рано прекращается, а у кого-то мутации, обеспечивающие карликовость, появились случайно. Существует несколько официально зарегистрированных пород минипигов, для них прописаны стандарты внешности и обязательно ведение родословных. Но для научных целей это не столь важно.

Человек-свинья обманывает иммунитет

Размер органов у свиней почти совпадает с человеческим, что делает возможной пересадку. Но как быть с иммунным отторжением? Можно, конечно, принимать препараты, которые будут подавлять активность иммунитета реципиента. Но это автоматически увеличит риск почти всех заболеваний (кроме аутоиммунных). Хорошо бы использовать не такой радикальный метод, а какой-нибудь более избирательный.

Один из способов предотвратить отторжение чужого органа — сделать его не совсем чужим. Для этого надо добавить в его «заготовку» клетки человека, которому он будет предназначаться, — притом не какие-нибудь зрелые и дифференцированные, а обладающие свойствами стволовых.

Это и попробовали проделать исследователи из Института Солка («Cell», 2017, 168, 3, 473—486.e15, doi:10.1016/j.cell.2016.12.036). Сначала они подействовали на фибробласты (клетки соединительной ткани) человека так, что те вернули себе свойства стволовых и стали индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК). В них внедрили ген, позволявший клеткам флуоресцировать. Далее по положению и интенсивности флуоресценции ученые определяли, содержат ли зародыши свиней человеческие клетки.

ИПСК ввели в эмбрионы свиней на стадии бластоцисты. Это один из самых ранних этапов формирования зародыша млекопитающего. Удобна бластоциста тем, что в ней есть полость, хорошо подходящая для введения в нее человеческих ИПСК. Всего бластоцист было 2181, в каждую из них ввели по 3—10 ИПСК человека. После инъекции человеческих клеток эмбрионы имплантировали в матки свиней и дали им развиваться в течение трех-четырех недель. Увы, только 186 тронулись в рост, а ИПСК обнаружили лишь в 67 из них. При этом три четверти свиных зародышей с человеческими клетками существенно отставали в росте от обычных, «бесчеловечных» эмбрионов.

Результат, конечно, далеко не стопроцентный. И все же радует, что ИПСК людей прижились хотя бы в некоторых зародышах свиней. Ведь авторы описываемой работы пробовали не только такой вариант пересадки. Они имплантировали крысиные стволовые клетки в эмбрионы мышей, а также либо мышиные, либо крысиные стволовые клетки в бластоцисты свиней. Химеры (так называют организмы, состоящие из клеток нескольких особей) двух видов грызунов доживали до момента рождения и чувствовали себя относительно хорошо, однако стволовые клетки мышей и крыс в эмбрионах свиней вообще ни разу не прижились. По всей видимости, дело в степени родства видов, из клеток которых пытаются составить эмбрион-химеру. Стоит радоваться, что в случае с человеческими ИПСК получилось хоть что-то.

Но как бы себя чувствовали химеры из свиней и людей после 28-го дня эмбрионального развития, никто не устанавливал по этическим причинам. А вдруг после этого срока необычные зародыши свиней становятся разумными и убивать их в таком случае нельзя? Это почти шутка, однако на всякий случай лучше перестраховаться.

Подведем итог: химер из клеток человека и свиней создать все-таки можно, и науке они почти наверняка сослужат хорошую службу. Хотя сейчас процент успешных трансплантаций человеческих ИПСК в бластоцисты свиней низок, его вполне можно поднять. Усовершенствованные методы редактирования генома позволят изменить гены, чьи продукты мешают «совместному проживанию» клеток человека и свиньи, и тем самым улучшить совместимость эмбриональных клеток разных видов. Ну а поскольку повысить точность редактирования в любом случае необходимо, над этим уже работают, и весьма интенсивно.

Создание свиней, в организме которых есть человеческие клетки

Избавляемся от лишнего

Но и этого недостаточно. Даже клетки таких химерных органов могут нести опасность для реципиента. Дело в том, что в геноме клеток свиней присутствуют эндогенные ретровирусы PERV (porcine endogenous retrovirus). Скорее всего, это потомки древних вирусов, осевшие в ДНК своих бывших жертв. Как правило, свиньям они не мешают, а вот в организме человека могут неожиданно активизироваться и даже нанести некий вред. Правда, на практике подобных случаев пока не зарегистрировали: живых свинолюдей не существует, а другой способ передачи PERV представителям нашего вида придумать сложновато, учитывая, что эндогенные ретровирусы встроены прямо в ДНК клеток свиней. И все же хорошо бы от PERV на всякий случай избавиться, благо средства для редактирования генома у нас уже есть.

Молекулярные биологи из США и КНР доказали, что такое избавление вполне реально («Science», 2017, 357, 6357, 1303—1307, doi:10.1126/science.aan4187). Они использовали технологию CRISPR, чтобы вырезать из ДНК клеток свиней их эндогенные ретровирусы. А PERV в свином геноме много: эти генетические элементы встречаются в нем аж в 62 точках. Тем не менее средство для редактирования ДНК выявило все PERV в культуре клеток почки свиньи и успешно их обезвредило. Правда, дальше возникла проблема: клетки, очищенные от эндогенных ретровирусов, в ряде случаев отказывались расти и делиться. Чтобы это исправить, к питательной среде добавили смесь веществ, активирующих названные выше процессы, и дезактивировали один из генов-супрессоров роста.

На успешной «очистке» культур клеток исследователи не остановились. Они создали эмбрионы, свободные от PERV. Для этого в яйцеклетках свиней разрушили их собственные ядра, а вместо них пересадили ядра клеток, отредактированных, как описано выше. Поскольку в клетках почки уже два набора хромосом (а в яйцеклетке изначально только один), оплодотворения тут уже не понадобилось. Отредактированные эмбрионы подсадили суррогатным матерям, и примерно из каждого сотого развился и родился вполне жизнеспособный поросенок. Процент успеха кажется небольшим, но примерно таков он и в случае клонирования без редактирования генома. Раз так, получается, что удаление PERV из ДНК свиней не снижает их жизнеспособности. А всего появилось на свет 37 свободных от эндогенных ретровирусов поросят.

Быть может, PERV и не надо удалять из будущего биоматериала для пересадки в организм человека: мы ведь не знаем наверняка, несут ли они вообще какую-то опасность для Homo sapiens. Однако это не главное. Важно, что это исследование показало: мы можем изменять ДНК клеток свиней нужным нам образом без ухудшения их жизнеспособности. А менять еще есть что. Существуют гены, провоцирующие иммунный ответ организма человека на клетки свиней, и их тоже надо обезвредить. А еще необходимо поменять состав свиной крови так, чтобы при контакте с человеческой они обе не сворачивались. Если все эти манипуляции удастся выполнить с помощью технологий редактирования генов таким образом, что клетки свиней не потеряют способности расти и размножаться, можно будет говорить о пересадке органов этих животных человеку гораздо более предметно.

Эта статья доступна в печатном номере "Химии и жизни" (№ 3/2018) на с. 28 — 29.