Регенерация от бактерий: из Сибири с любовью

В начале сентября во Владивостоке на базе Школы биомедицины Дальневосточного федерального университета прошла большая международная конференция «Future of biomedicine», где ведущие специалисты мира в области генетики, биополимеров, молекулярной медицины и других смежных областей делали доклады обо всех новинках в этом научном поле. О новом классе биоразлагаемых биополимеров рассказала красноярский биофизик Екатерина Шишацкая, заведующая кафедрой медицинской биологии Института фундаментальной биологии и биотехнологии Сибирского федерального университета. Кстати, в 2009 году Екатерина стала лауреатом премии президента России в области науки и инноваций для молодых ученых, а ее исследования данного класса биоразрушаемых полимеров обеспечили приоритет и мировую известность научной школы России. Статья для «Химии и жизни» о тех задачах, которые решают в лабораториях новых биоматериалов Сибирского федерального университета и хемоавтотрофного биосинтеза Института биофизики Сибирского отделения РАН, где работает Екатерина Шишацкая, подготовлена при участии научного журналиста Анны Хоружей.

Екатерина Шишацкая и Анна Хоружая

Зачем мы занимаемся регенерацией

Голубая мечта многих исследователей — создать искусственные ткани и органы без каких-либо ограничений по размерам или функциональности. Одно из ключевых понятий в этой области — направленная регенерация тканей, и об этом мы поговорим подробнее.

Любая ткань и орган состоят из соединительнотканных опорных структур (стромы, или внеклеточного матрикса) и специализированных клеток. В норме клетки сами поддерживают свою ткань. Например, клетки кости — остеобласты синтезируют кальций, входящий в состав внеклеточного матрикса костной ткани, обеспечивая необходимую прочность. При переломах кости восстанавливаются за счет резервов собственных клеток, и никаких технологий, кроме обеспечения неподвижности отломков, не требуется. Другие ткани обладают такими же свойствами, в большей или меньшей степени. Здесь, разумеется, есть нюансы, но в принципе на здоровом человеке все заживает, «как на собаке». Вопрос лишь в том, какой ценой.

Часто при заживлении происходит замена ткани на менее специализированную, что ведет к утрате функции. Раньше, например, если больной зуб начинал крошиться, в итоге у человека становилось на один зуб меньше, и его это не волновало — по большому счету он был здоров. До появления доступного протезирования беззубых людей было множество. Лунка от зуба заполняется мягкой соединительной тканью — но не костью, и человек жует оставшимися зубами. Если же отсутствует много зубов, да еще и подряд, то полноценное жевание невозможно и со временем атрофируется так называемый альвеолярный отросток челюсти (в котором раньше располагались корни зубов), так как мягкая соединительная ткань форму не держит и нагрузкам, в отличие от кости, не сопротивляется. Всем знаком этот печальный облик: деформирован рот, да и все лицо, внешность несет отпечаток дряхлости. Но причина данного явления — не возраст, а только утрата зубов и атрофия альвеолярных отростков. Характерные внешние признаки могут проявиться даже у достаточно молодых людей, если они потеряли зубы и не поставили функционально полноценных протезов. В современном мире мало кого устраивает такой имидж.

И вот тут выступают на передний план технологии направленной регенерации тканей. Продолжая стоматологическую тему — конечно, хотелось бы, чтобы современные технологии заменили нам утраченные зубы новыми, с крепкими корнями. Однако стоматологи пока ограничиваются обеспечением роста кости в лунках от зубов, чтобы потом туда установить металлические имплантаты, а затем на них — красивые керамические коронки, внешне неотличимые от натуральных зубов. Как обеспечивают рост кости? Например, имплантируя специальные мембраны, препятствующие врастанию мягкой ткани в лунку: кость растет значительно медленнее мягкой соединительной ткани, а мембрана дает ей дополнительное время. Кроме того, в лунку помещают разнообразные «затравочные» материалы, ускоряющие минерализацию растущей кости. Часто стоматологи используют для заполнения объемные, или, по-модному, 3D-блоки, материал для которых получают из костей крупных животных, обработанных специальным образом, так что они полностью лишаются клеток и антигенных свойств. Эти блоки становятся каркасом, который прорастает остеобластами пациента и минерализуется, что значительно ускоряет процесс протезирования.

Микропористые пластины из ПГА. Пористость сделана с помощью лазера

Феномен направленной регенерации можно использовать в различных клинических ситуациях, для заполнения больших дефектов тканей и даже получения целых органов, применяя искусственный аналог внеклеточного матрикса, соответствующий специфическим признакам и потребностям, — это и есть наша цель. Множество современных исследований в этом направлении предполагают сначала девитализацию («обесклеточивание») ткани или органа животных, а затем заселение их нужными клетками, но уже в условиях ex vivo, то есть вне организма, в лабораторных культивационных сосудах. Мы с самого начала упорно продвигаем на роль тканевых каркасов трехмерные изделия на основе полимеров карбоновых кислот — полигидроксиалканоатов (ПГА), синтезируемых специфическими микроорганизмами в условиях несбалансированного роста. (Почему несбалансированного — об этом расскажем дальше.) Наше преимущество в том, что эти полимеры абсолютно биосовместимы и полностью биоразрушаемы, причем последним свойством можно управлять — подгонять скорость биоразрушения под конкретную ткань, изменяя химический состав и структуру.

Идеальная кость

Разумеется, всех интересует регенерация конечностей. Это страшно, когда кость руки или ноги раздроблена на множество осколков, которые невозможно соединить, и, хотя мягкие ткани относительно сохранны, показана ампутация всей конечности. Но если убрать все осколки и заменить кость на новую, искусственную, мы сохраним конечность. Что для этого нужно? Подобрать по размерам хороший искусственный 3D-каркас и дать возможность клеткам пациента его заполнить.

Мы занимаемся биосовместимыми и биодеградируемыми материалами много лет. Наша задача — создать такой материал, который будет работать везде: в кости, в мышцах, в паренхиматозных органах, коже, серозных оболочках... Почему бы нет? Мы хотим разработать идеальное сырье для внеклеточного матрикса разных тканей и при этом исходим из нескольких базовых понятий. К искусственным каркасам есть ряд важных требований: они должны быть абсолютно безвредными, то есть не оказывать на организм никаких побочных эффектов после имплантации, биосовместимыми именно с этой тканью, выполнять функцию натурального каркаса, пока не сформируется новый, и быть биодеградируемыми — когда сформируется новая ткань, они должны полностью исчезнуть, причем продукты биодеградации должны быть безвредными.

В отношении функции есть тонкости. Например, множество команд исследуют гидрогели для замещения дефектов той же кости; но они уступают по исходным физико-механическим характеристикам девитализированной кости (проще говоря, слишком мягкие), так стоит ли тратить время?.. Большие дефекты будут замещаться слишком медленно, а небольшие зарастут и без тканевой инженерии. Также исследуют достаточно жесткие материалы для восстановления покровных тканей — кожи, например, либо эластичных хрящей; наивно полагать, что такой каркас хорошо приживется.

Наши материалы синтезируют в определенных условиях специальные микроорганизмы. Самый первый из них, поли- 3-гидроксибутират, — весьма твердый и прочный. Наличие в цепи мономеров 3-гидроксивалериата добавляет материалу эластичности, а 3-гидроксигексаноата — в еще более заметной степени. Есть и другие мономеры, которые существенно изменяют физико-механические свойства. При этом мы «заставляем» материалы сохранять биосовместимость и биоразрушаемость. Множество составов и широкий спектр свойств — именно такие материалы в перспективе решат вопрос идеального внеклеточного матрикса.

«Поддержите микроба! Единственная культура, имеющаяся у некоторых людей, — бактериальная». К тому же бактериальные культуры производят вещества, жизненно важные для нас

Типичный недостаток продуктов, производство которых связано с микроорганизмами, — наличие в них примесей, компонентов мембраны, которые вызывают отрицательные иммунные реакции. Медиков это всегда беспокоит. У нашей группы есть запатентованная методика очистки материала до необходимого для имплантаций качества. Это в некотором роде коммерческая тайна, в других группах так не делают.

Далее нельзя не отметить, что ПГА синтезируются множеством микроорганизмов и мономеры могут быть в них в разных соотношениях, однако не все штаммы можно использовать в промышленных, массовых условиях. Это еще один наш плюс — у нас свой штамм, подходящий для промышленного производства.

Конечно, сейчас ставят качественные «неживые», но функциональные имплантаты, например металлические — в травматологии и стоматологии. Это гораздо лучше, чем ничего, пациенты довольны. Но все-таки хочется — и очень нужно — создать структуру, анатомически близкую к естественной, чтобы люди не «звенели» в аэропортах и не имели пожизненных противопоказаний к некоторым видам лечения и обследования, например, связанным с использованием магнитов (МРТ).

Еще один важный момент: материал, с одной стороны, должен выполнять функциональную нагрузку в теле, а с другой — должен быть пригодным для предимплантационной обработки, таким, чтобы его можно было расплавить, отлить в форме, пропустить через 3D-принтер, распилить, отфрезеровать, подогнать по месту... — иными словами, материал должен быть конструкционным. При сохранении обязательной биосовместимости и контролируемой биоразрушаемости это весьма усложняет задачу.

Волокна и хрящи

Если говорить о «3D», то очень перспективно производить из полимеров изделия на основе ультратонких волокон, получаемых методом электростатического формования раствора — электроспиннинга. Можно делать маты с ориентированными и неориентированными волокнами, мы видим, что клетки ведут себя на них по-разному. Однако в целом биосовместимость достаточно хорошая, остается подогнать биоразрушаемость под конкретную задачу. Толщина матов, которые мы делаем в лаборатории, может быть от 10 до 30—50 мкм, ширина — до двух десятков сантиметров. Медики хотели бы получить «войлок» в 5—6 см толщиной, из которого можно было бы вырезать фрагмент нужного размера и формы, вставить по месту в мягкие ткани и подсадить в него клетки. Но такой установки у нас пока нет. Можно использовать пресс, тогда получаются блоки — кирпичики, которые найдут применение, например, в челюстно-лицевой хирургии. Пористость можно получать по-разному, в том числе с помощью лазеров и плазменной обработки. Один кирпичик, три или половинка — в зависимости от того, какое отверстие нужно заполнить. Или насыпной материал — маленькие ежики, миллиметрового размера, которые насыпают в лунку, и очень быстро формируется кость. Такого рода материалы мы можем начать делать хоть прямо сейчас. Но для того, о чем я мечтаю, — целая трубчатая кость, фаланга пальца, а лучше все три — возможностей еще недостаточно.

С хрящевыми структурами еще сложнее, хрящи имеют другие физико-механические характеристики. Но все же у нас есть мысли сделать элементы трахеи, бронхов. К примеру, когда развивается злокачественная опухоль центрального бронха, — это трагичная ситуация: удаляют и опухоль, и все, что ниже, то есть человек лишается легкого и становится инвалидом навсегда. А если поставить пять сантиметров трубки, то легкое удастся сохранить. Мне постоянно говорят: «Ну хорошо, не можешь дать пять сантиметров, а четыре можешь?» Говорю, могу, но скажите, как вы его пришивать будете? Проблема в том, что трубка, которую можно сейчас сделать, достаточно твердая, и ее сложно прикрепить к мягкому и эластичному живому бронху. Нужен другой подход для переработки полимерного сырья, его еще предстоит разработать.

Шаги к практике

От медиков мы получаем очень много запросов, уже набралась целая папка. Есть замечательные специалисты, которые могут четко сформулировать, что им надо: размер, длину, ширину, вес... Один нейрохирург просил заготовки для искусственных тел позвонков и межпозвоночных дисков, с указанием размеров, в количестве 30 штук! Это уже маленькая промышленная партия, а у нас лаборатория. Отвечаем: мы не можем сделать так много. Тогда он спросил, можем ли мы прислать один кусок 55—60 см, а они сами выпилят, что им нужно. К сожалению, мы не делаем полимерные бруски на продажу. Пока не делаем. Как правило, в работе образцы по размерам дефектов, которые можно сделать в тканях на некрупных животных, таких, как крысы, маленькие собаки.

А бывают совершенно абсурдные запросы, видно, что люди не представляют, куда они хотят проникнуть. Какая-то повальная увлеченность биополимерами, не всегда оправданная. С одним человеком, врачом, имеющим степень, я переписывалась достаточно долго, пыталась из него вытянуть «техническое задание». Запрос: мне нужна трубка из вашего материала, буду делать нерв. О'кей, отвечаю, пришлите характеристики: диаметр, длина, гибкость, прочность на разрыв, скорость биодеградации трубки нервного кондуита. К примеру, хирурги всегда ругаются, когда шовные нитки тянутся, сосудистая стенка, напротив, должна растягиваться и сокращаться очень значительно. А что нерв? Вместо ответа человек присылает чужой обзор, где указана скорость роста периферического нерва человека. «Вы будете работать с людьми?» — «Нет». — «С крысами?» — «Нет». — «А с кем?» — «Я не знаю, я буду пробовать». Пробовать он хотел, кажется, на кошках. Это не регенеративная медицина, а садизм. Изготавливать материалы, а тем более изделия с никому не известными свойствами, для того чтобы кто-то попробовал, бессмысленно — это не наша вредность, это нежелание тратить время. Ясно, что дальше одной статьи такая работа не двинется.

Была проблема с медицинской частью — потеря результатов. Хирурги — они ведь все герои, они спасают человеческие жизни! И вот кому-то пришла мысль что-то сделать с нашим полимером. Пробуют на животных и часто работают чуть менее ответственно, чем хотелось бы, — забывают отчитаться, что же вышло. А нам ведь важен именно этот результат. Пусть не окончательный, но до окончательного мы никогда не доберемся без этих маленьких промежуточных результатов, которые, как правило, не интересуют врача, основное время работающего с людьми. Не получилось на кролике — он уходит и забывает о нас. Чтобы учиться на неудачах и улучшать материал, нужен настоящий исследовательский центр регенеративной медицины, со штатом квалифицированных медиков, ориентированный именно на получение этих промежуточных результатов на пути к окончательному. Мы очень много лет потеряли на этом: дали материал, его имплантировали, что-то получилось, но, конечно, «не космос» — и все, никакого продолжения. Но откуда взяться сногсшибательному результату, если нет обратной связи, если мы не будем менять составы, молекулярную массу и т.д. Сейчас эту проблему мы от себя отодвинули — просто не сотрудничаем с теми, кого не знаем. Есть серьезные медики, которые с нами работают много лет, и мы продвигаемся вперед.

Внедрение и коммерциализация разработок — отдельная сложная тема. Пять лет назад мы ездили в Соединенные Штаты: американский исследовательский фонд Civilian Research and Development Foundation проводил конкурс по университетам, и от каждого крупного университета поехали представители-разработчики, которым рассказывали, что такое стартап, коммерциализация научного процесса, кампания, инвестор... Для меня, например, было удивительно, что на каждом этапе исследовательского процесса надо уже отпочковывать что-то, что будет приносить прибыль, а не ждать, когда получится сделать, скажем, в нашем случае, целый скелет человека. Следует извлекать прибыль на каждом этапе продвижения, только тогда процесс имеет шанс закончиться на заводе, производящем ваш товар. Иначе тупик.

Бактериальный «целлюлит» и регенеративная медицина

Многие родившиеся в 50—60-е годы помнят выражение «single cell protein». Люди помоложе удивляются, что это за «белок одинокой клетки», а биологи — ровесники наших родителей сразу вспоминают: не «одинокой», а одноклеточных. В то время человечество захотело покончить с дефицитом полноценного пищевого белка путем выращивания микроорганизмов — собственно микробные тела и были источником белка, который после обработки становится достаточно близким к животному.

Клетки с белковой «программой синтеза»

В нашем институте этой проблемой занималась группа, где работала профессор Татьяна Григорьевна Волова. Была проведена огромная работа по оптимизированию и масштабированию процесса, анализу качественного состава этого белка, разработке технологических режимов производства в промышленных масштабах — потому что белка нужно было много. Белковое голодание, особенно в развивающихся странах, и сегодня остается частой причиной смертности.

Проблема это глобальная: не хватит всех ресурсов Земли, чтобы прокормить скот в количестве, необходимом для удовлетворения потребности всех людей планеты в мясе. Все равно кому-то придется питаться рисом или овощами. И чтобы всем хватило нормального, животного белка, придумали такой выход. Сегодня корма для животных действительно готовят с добавлением бактериального белка, так что свой вклад в решение продовольственной проблемы эта идея внесла.

Эксперименты по замене животной части кормов биомассой водородных бактерий в рационе сельскохозяйственных животных были весьма успешными

Это было очень мощное движение во всем мире. В нашем институте стоял ферментационный аппарат с рабочим объемом две тонны, во взрывобезопасном исполнении — с толстыми стальными стенками (в качестве субстрата для микроорганизмов использовали взрывоопасные газовые смеси). Ферментер находился в отдельном корпусе, его обслуживал коллектив примерно из двадцати человек. Сейчас много ругают советскую науку, но все было сделано очень четко. По заказу наших специалистов на заводе построили ферментер, перевезли его по железной дороге в Красноярск. Там в течение нескольких месяцев отработали процесс биосинтеза, запустили производство и получали клеточную массу в огромных количествах. Потом ее отправляли в московские институты на исследования, для оценки полноценности белка. В колхозах несколько лет откармливали сельскохозяйственных животных: свиней, птиц, песцов, анализировали состав их мяса, качество шерсти. Потом советская наука закончилась, тематика закрылась, установку демонтировали, ферментер сдали в металлолом. Здание арендовал компьютерный клуб. А результаты по масштабированию роста водородных бактерий остались — хотя бы на бумаге, в статьях и патентах.

Теперь о том, какое отношение имеют производители кормовых белков к биополимерам. Чтобы оптимизировать процесс, Татьяна Григорьевна манипулировала условиями роста микроорганизмов. В каких-то неоптимальных условиях микробы вместо того чтобы делиться и наращивать богатую белком биомассу, прекращали рост и начинали накапливать внутри себя какие-то цепочки гранул, как потом выяснилось, с резервными энергетическими макромолекулами, — своего рода целлюлит одноклеточных. Сначала отрабатывали такие режимы, при которых этого не было, и успешно нарабатывали тонны белковой биомассы. А потом появились сообщения, что содержимое гранул — весьма интересная субстанция. Интересная именно тем, что она накапливалась внутри бактериальной клетки, а затем, при изменении условий, исчезала. Значит, должны существовать внутриклеточная полимераза — фермент, синтезирующий этот полимер, и деполимераза — разрушающий фермент. Кто-то задал вопрос: а только ли внутри микроба идет деполимеризация или клетки высших организмов тоже могут разрушать этот полимер? И если могут, то нельзя ли сделать из него биодеградируемый имплантируемый материал?

Клетка Ralstonia / Wautersia eutropha B 5786 с «программой синтеза»ПГА. Гранулы по периметру клетки содержат ценный полимер

Оказалось, что можно оптимизировать процесс культивации так, что этих веществ в клетке будет очень много, и выделять их. Это и были полигидроксиалканоаты (ПГА). В нашем институте сумели довести их выход до 95% от сухой массы клеток. И в общем, все импланты, о которых говорилось выше, можно делать из полигидроксиалканоатов без добавления каких-либо иных веществ, пластификаторов, сшивающих агентов или, наоборот, разрушающих. Эти молекулы прямо волшебные, на мой взгляд, они ведут себя как живые существа. У них может быть огромный молекулярный вес, а потом они последовательно распадаются на мономеры, и вот уже нет ничего, кроме воды и СО₂. Чистая магия.

Напоследок замечание, не связанное с медицинской тематикой, просто как иллюстрация возможностей биоразлагаемых материалов. Для них буквально напрашивается еще одно применение: производство упаковки, пленок и пакетов взамен полиэтиленовых и пр. Тут, конечно, проблема с ценой, за которой в медицине мы не постоим, а вот, например, дружественное к природе, но дорогое ведро или губку купит не каждый. Однако для таких целей требования к чистоте материалов совершенно другие, и стоимость в разы меньше. Вообще поразительно, насколько велика приспособляемость биосферы. Даже те ужасные и тяжелые пластики, из которых сейчас сделано почти все, в каком-то смысле стали биодеградируемыми: природная микрофлора изменилась и научилась их разрушать. Это странно, но факт: современные бактерии могут есть пластик! (См. «Химию и жизнь», 2013, № 8, «Пластисфера как часть биосферы». — Примеч. ред.)

Есть такая знаменитая фраза японского ученого Кэндзи Сакагучи: «Ищите все, что пожелаете, у микроорганизмов, и они не подведут вас...» Конечно, так оно и есть.