Две дамы, ДНК и мышьяк

Инопланетная бактерия из калифорнийского озера

Женщинам-ученым на заметку, тем, кто размышляет над собственным образом, ищет примеры для подражания: присмотритесь к доктору Розмэри Редфилд из университета Британской Колумбии (Ванкувер). «Она ворвалась в блогосферу подобно выстрелу — канадский микробиолог с безумной прической и склонностью к откровенным высказываниям» — так начинается рассказ о ней в предновогоднем номере «Nature» 2011 года. На самом деле она выглядит как типичный строгий профессор, если не обращать внимания на цвет волос — сиреневый на фотографии в «Nature», ярко-розовый на юзерпике в сетевом дневнике.

Дневник у Розмэри Редфилд (http://rrresearch.fieldofscience.com/) необыкновенный. В нем почти нет фактов из личной жизни, это что-то вроде лабораторного журнала онлайн — отчеты в свободной форме о текущей работе и результатах, а также о подготовке публикаций, конференциях и других мероприятиях. Хозяйка блога, как и все правильные блогеры, постит интересные фотки — с культурами микроорганизмов, электрофорезом ДНК в геле. Читать записи, начатые еще в 2006 году, может любой желающий. Непривычный уровень открытости для российской науки, да и для зарубежной тоже. Хотя вот у них есть независимая сеть научных блогов Field of Science, тот самый ресурс, на котором находится блог Розмэри Редфилд, есть и другие подобные ресурсы — однако редко бывает, чтобы сырые лабораторные данные, планирование экспериментов, возможно, с ошибками и недочетами, выкладывали всем напоказ, читай и комментируй кто хочет. Доктор Редфилд — сторонница «open science», максимально быстрого и свободного обмена информацией: «У ученых теперь гораздо больше возможностей общаться с теми, кого они не знают, и учиться у людей, которых они никогда не встречали». Вместе со многими другими учеными она подписалась под решением бойкотировать журналы крупнейшего издательского дома «Elsevier» из-за их «антинаучных действий» (запредельно высоких подписных цен и поддержки законов против пиратства) и своих читателей призвала к тому же. А читателей в этом году у RRResearch наверняка прибавилось.

Розмэри и Фелиса: шуточный коллаж, опубликованный в веблоге Gizmodo (обзоры технических новинок и новости науки) в декабре 2010 года

Год назад («Химия и жизнь», 2011, № 2) мы писали о том, как Фелиса Волф-Саймон из Геологической службы США, работая по гранту NASA, вместе с коллегами выделила из образцов калифорнийского озера Моно необыкновенных бактерий. Вода озера Моно имеет рН 9,8, содержание солей в ней около 90 г/л, в том числе арсенитов AsO33- и арсенатов AsO43- . Концентрация мышьяка в этой воде оценивается как 200 мкМ. Существа, которые живут в озере Моно, должны быть очень необычными — возможно, настолько необычными, чтобы из менить фундаментальные догмы биохимии. Исследователи ставили перед собой амбициозную цель: найти организм, у которого фосфор заменен мышьяком. В конце концов, тот и другой — элементы пятой группы, и химические свойства у них сходны.Может быть, обитатели мышьякового раствора сумели превратить яд в необходимый компонент питания? Интерес NASA тут очевиден: расширение понятия «условий, пригодных для возникновения жизни».

Фелиса Волф-Саймон покусилась на святое — на Самую Главную Молекулу. Они с соавторами подробно изучили найденную бактерию. Анализ рибосомной 16S РНК показал, что она принадлежит к роду Halomonas. (О том, как ученые сравнивают нуклеотидные последовательности и строят «родословные древа» по этим данным, мы писали много раз.) Представители этого рода — галофилы, «любящие соль», и многие отыскали себе весьма странные экологические ниши. (Знаменитость среди них — Halomonas titanicae, найденная на обломках «Титаника» аппаратом «Мир-2»; железом «Титаника» она и питается.) Новый штамм получил название GFAJ-1, от Give Felisa A Job — «дайте Фелисе работу». Согласно данным первооткрывателей, этот штамм способен расти на среде, практически не содержащей фосфора, а главное — использовать для синтеза ДНК арсенаты вместо фосфатов! Этот сенсационный вывод как будто бы подтверждался и анализом ДНК в агарозном геле — мышьяк в образце был. (См. «A Bacterium That Can Grow by Using Arsenic Instead of Phosphorus», Felisa Wolfe-Simon et al., онлайн-публикация 2 декабря 2010 года, doi: 10.1126/science.1197258, публикация в журнале «Science» от 3 июня 2011, т. 332, № 6034, с. 1163—1166.)

Зимой 2010—2011 годов, после онлайн-публикации и пресс- релиза NASA, естественно, поднялся шум: «Найден новый элемент жизни» и даже: «Ученые обнаружили на Земле инопланетных бактерий»... Научное сообщество было настроено скептически. Допущение, мягко говоря, смелое — хотя бы потому, что эфиры мышьяковой кислоты в физиологических условиях гидролизуются гораздо легче, чем эфиры фосфорной кислоты, а значит, каждый мышьяк вместо фосфора — готовая точка разрыва в ДНК. Добавим, что арсенаты в тех же условиях имеют тенденцию превращаться в арсениты. В общем, мышьяк — не такая хорошая замена фосфору в ДНК, как кажется при беглом взгляде на таблицу Менделеева. И главное, не нарушает ли это предположение «бритву Оккама»? Мало ли известно экстремофильных видов бактерий, и все они пользуются одним и тем же универсальным носителем информации — ДНК из четырех стандартных нуклеотидов.

Розмэри Редфилд была среди самых строгих критиков Фелисы Волф-Саймон и соавторов. Ее лаборатория как раз и занимается бактериальной ДНК, в частности выясняет, при каких условиях бактерия захватывает нуклеиновые кислоты из внешней среды и зачем она это делает — ради усвоения наследственной информации или просто питается. (Сама доктор Редфилд поддерживает вторую точку зрения, далеко не общепринятую.)

Никаких убедительных доказательств

Хорошо, допустим, штамм GFAJ-1 — единственный в природе феномен. Но уникальному объекту — уникальная добросовестность исследователей, а сенсационным выводам, потрясающим основы биохимии, — неоспоримые доказательства. Ни тем, ни другим авторы работы похвалиться не могли. Волф-Саймон и соавторы проанализировали методом масс-спектрометрии фрагмент агарозного геля, содержащий ДНК из GFAJ-1. (Электрофорез в геле — обычный способ выделения фрагментов ДНК определенной длины. Из-за тех самых остатков фосфорной кислоты, входящих в ее состав, ДНК заряжена отрицательно и в электрическом поле движется к плюсу, а скорость движения зависит от размера молекулы.) В образце был обнаружен мышьяк. Однако 99% анализируемого материала составляла агароза, а не сама ДНК, то есть назвать такой образец чистым никак нельзя. Между тем выделение ДНК из агарозы — рутинная процедура; почему, спрашивается, это не было сделано? Далее, кто доказал, что мышьяк не сорбирован на молекуле ДНК, а входит в ее состав и соединен ковалентными связями с остатками дезоксирибозы? Если бактерия буквально купается в мышьяке (а выращивали штамм на среде с 40 мМ мышьяка — куда больше, чем даже в озерной воде!), ничего не стоит занести его в пробу ДНК. Наконец, почему бы не предположить, что бактерии для выживания могло хватить мизерных примесей фосфата, которые в арсенате всегда имеются по причине того же самого сходства химических свойств? Кстати, в воде озера Моно его молярная концентрация фосфора вдвое выше, чем у мышьяка, — в естественной среде бактерия от дефицита фосфора никак не страдала.

«Статья не содержит НИКАКИХ убедительных доказательств того факта, что мышьяк включен в ДНК или какую-либо иную биомолекулу», — написала Розмэри Редфилд в своем блоге 4 декабря. Она отметила, что высокотехнологичным методам определения содержания мышьяка, вроде масс- спектрометрии, предшествовали крайне примитивные методы выделения и очистки, а также подвергла сомнению сделанные авторами оценки минимального необходимого для жизни содержания фосфора в среде. Резюме беспощадно: «Если бы такие данные представил студент-дипломник, я бы отправила его обратно на рабочее место, выполнять дополнительную очистку и ставить контроли. Есть разница между контролями, которые ты ставишь, чтобы честно проверить свою гипотезу, и теми, которые ставят, чтобы показать, что гипотеза верна». Были там и обидные намеки на то, что небрежности исследователей могло способствовать давление со стороны NASA, увлеченного поисками «инопланетной жизни». (Можно понять людей, добывающих деньги на звездную науку, но поймите и профессионалов, на чьем поле вдруг возникают астробиологические сенсации, по большей части нездоровые.) Тогда же, в декабре, Розмэри Редфилд отправила в «Science» письмо с критикой работы Волф-Саймон и соавторов и, конечно, сдублировала его в свой блог.

Доктор Редфилд сразу подчеркнула, что не намерена заниматься травлей «провинившихся» и не имеет в виду ничего личного. 10 декабря, после того как «ABC News» опубликовало фрагменты ее телефонного интервью, в блоге появляется открытое письмо к Фелисе Волф-Саймон с извинениями: как часто бывает, написанное выглядело жестче произнесенного. (Потом журналисты внесли изменения в публикацию.) «Я говорила интервьюеру, что хотя и считаю ваши выводы ошибочными, но в то же время сочувствую трудному положению, в котором вы оказались. Я сама около 20 лет защищала гипотезу, которую почти все считали неверной... Главное в науке не то, ошибаемся мы или нет (ошибаемся мы все), а то, как мы справляемся с этим». Правда, все это не помешало доктору Редфилд весной 2011 года перепостить анонимную первоапрельскую шутку о том, что Фелиса Волф-Саймон — инопланетянка с секретным заданием: дискредитировать в глазах научного сообщества поиски внеземной жизни.

Ответы Волф-Саймон и соавторов на заданные им вопросы по методической части удовлетворили далеко не всех. В записи от 17 декабря Редфилд рассматривает «еще одну причину, почему заключения Волф-Саймон невероятны». Помимо методических и химических неувязок есть биологический, эволюционный аспект. Нам говорят, что авторы обнаружили представителя гипотетической «теневой биосферы». Но если она существует, то ее представители должны были эволюционировать независимо от всех остальных живых существ в течение миллиардов лет. Однако секвенирование 16S рибосомной РНК штамма GFAJ-1 показало принадлежность бактерии к хорошо известному бактериальному роду. Есть в этом явная несообразность...

А если предположить, что эти бактерии не строят ДНК из мышьяка, они просто заменяют фосфат арсенатами в некоторых точках? Такая частная полезная адаптация, возникшая в условиях нехватки фосфора? Тоже не получается. Радиус атома мышьяка больше, чем у фосфора, связи его с кислородом на 13% длиннее — после таких точечных замен двойная спираль должна утратить форму, с ней не смогут работать никакие ферменты, обслуживающие ДНК. Плюс легкий гидролиз по эфирам арсената: десять замен разорвут цепочку ДНК на 11 частей. Короче говоря, вреда от такой «адаптации» получается заметно больше, чем пользы. И кстати, напомним еще раз, что нехватки фосфора в озере Моно нет.

На беспристрастный взгляд, всего этого более чем достаточно, чтобы раз и навсегда покончить с мышьяковой ДНК. Но пресс-релизы NASA и публикация в «Science» выводили эту теорию из ряда ей подобных, заставляя считаться с ней.

Кто может, сделает лучше

Итак, 3 июня состоялась бумажная публикация статьи Волф-Саймон и соавторов. Все это время, начиная с декабря, обсуждалась онлайн-публикация на сайте, и вместе со статьей были опубликованы восемь технических комментариев — вопросы возникли не только у Редфилд. Никаких новых экспериментальных данных авторы статьи за это время не представили, на критику отвечали в стиле «наша интерпретация может оказаться и верной, при условии, что...». Зато они предоставили другим ученым доступ к штамму GFAJ-1. «Самый поразительный аспект официальных ответов авторов статьи — они так и не признали, что сделали какие-либо ошибки. Это даже как-то неловко, учитывая, сколько замечаний поступило».

Наконец 27 мая хозяйка блога приходит к мысли: хочешь, чтобы что-то было сделано хорошо, — сделай это сам. «Я говорила, что никто из ученых не будет тратить время и ре- сурсы, чтобы проверить утверждения Волф-Саймон и соавт., поскольку вероятность того, что они справедливы, исчезающе мала. Но я переменила свое мнение, так как наиболее важные утверждения, по-моему, очень легко проверить. Поэтому я только что отправила электронное письмо... чтобы узнать, как получить штамм GFAJ-1. (...)

Главные вопросы, на которые надо ответить:

1. Примерно десятикратное различие в росте штаммов на +As/-P и -As/-P (обозначения для культуральной среды, содержащей мышьяк, но не фосфор, и не содержащей ни мышьяка, ни фосфора соответственно. — Е.К.) было вызвано включением мышьяка вместо фосфора в ДНК, РНК и другие биомолекулы?

2. Содержит ли ДНК, выделенная из клеток, которые росли в условиях избытка мышьяка и недостатка фосфора, существенные количества ковалентно связанного мышьяка?»

И тут же доктор Редфилд набрасывает прописи экспериментов. Начать, по ее мнению, следует с привлечения к работе химиков, владеющих методом масс-спектрометрии, чтобы они проверяли содержание As в ДНК (и при необходимости As и P в культуральных средах — если понадобится точно узнать количество примесей в «бесфосфатной» среде или эффективность потребления элементов бактериями). Микробиологическая и молекулярно-биологическая части работы тривиальны. Нужно приготовить такие же среды, как были у Волф-Саймон и соавторов (с 40 мМ арсената и различными количествами фосфата), и вырастить культуры GFAJ-1. Обязательно наблюдать за ростом клеток, лучше всего напрямую, подсчитывая их количество под микроскопом с помощью специального приспособления — гемоцитометра. (Темпы деления клеток подскажут, как они себя чувствуют.) Затем, когда рост остановится, собрать клетки центрифугированием, аккуратно выделить ДНК и отдать чистый препарат соавтору-химику. Если в ДНК бактерий из мышьяковой среды мышьяка будет не больше, чем в контроле, выращенном на фосфате, ответ на второй вопрос — «нет». А если конечная плотность клеток, выращенных на разных средах, будет пропорциональна содержанию в них фосфата, и на первый вопрос ответ будет «нет». «Список работ выглядит внушительно, однако на самом деле все, что делается после выращивания бактерий, можно выполнить в один день».

«Конечно, для каждого эксперимента самый важный практический вопрос: "Будут ли эти результаты опубликованы?" Я думаю, будут. Лучше всего было бы, чтобы несколько независимых лабораторий сделали один и тот же тест и вместе опубликовались. (...) С другой стороны, у всех нас есть дела и поважнее».

Дальше перейдем на прямой пересказ и цитирование блога. Перед нами репортаж об эксперименте в режиме реального времени.

1 июня.

Доктор Редфилд ведет переписку по поводу получения GFAJ-1 и приступает к изучению техники безопасности при работе с арсенатом. Не знаем насчет инопланетных форм жизни, а для нас, земных организмов, мышьяк вреден, и лабораторная работа с ним — отдельная проблема. Тема безопасности продолжается и в следующие дни. Поскольку блог не есть официальный документ, в нем появляется несколько не вполне академических фраз по поводу службы химической безопасности университета и нормативных бумаг.

21 июня. Начинаем работать с GFAJ-1!

«Бактерии прибудут сегодня, так что пойду готовить среды.

Я планирую сначала выращивать их на разных концентрациях фосфата и без арсената. Это позволит определить, при ка-их концентрациях нехватка фосфата в отсутствие арсената лимитирует рост. После того как я тщательно охарактеризую рост, я проверю эффект от добавления арсената в среды с ограничением по фосфату, выделю и очищу ДНК из разных культур. Уровни фосфора и мышьяка в ДНК и культуральных средах определят методом масс-спектрометрии Леонид Кругляк и Джош Рабинович» (оба — из Принстонского университета, США, впоследствии соавторы статьи. — Е.К.).

21 июня. Вот они!

«Колонии маленькие, их плохо видно на фотографии. Но в чашке Петри их множество».

Чашка Петри с колониями «мышьяковой бактерии» GFAJ-1

22 июня. Считая клетки GFAJ-1.

«Я посмотрела под микроскопом полученные клетки GFAJ-1.

В статье Волф-Саймон и соавторов не говорится, что они подвижные, но, когда видишь, как они носятся туда-сюда, это обнадеживает.

Но какие же они маленькие! Не такие крошечные, как Haemophilus influenzae (патоген человека, любимый объект в лаборатории Редфилд. — Е.К.), но меньше, чем E.coli. Из-за размера считать их с помощью гемоцитометра непросто — он достаточно толстый, чтобы сбивать оптику микроскопа, особенно при большом увеличении, и в глазах у меня плавают пятна, которые не мешают в обычной жизни, но выглядят в точности как GFAJ-1 под микроскопом.

Волф-Саймон, чтобы считать клетки, подкрашивала их флуоресцентным красителем акридиновым оранжевым. А ведь он есть в нашей обширной коллекции красителей (сохраненной от прежней лаборатории, которую закрыли; большую часть их мы никогда не использовали). И у микроскопа есть флуоресцентная подсветка благодаря инвестициям соседней лаборатории — надо будет спросить их, как ей пользоваться».

24 июня. Витамины — для недотеп.

«Клетки GFAJ-1, которые я посеяла на чашку Петри, растут, и куда быстрее, чем я смела надеяться. Менее чем через 48 ч уже видны маленькие колонии. (...) Я боялась, что они не будут расти вообще, поскольку среда не содержала смеси микроэлементов, которую добавляли Волф-Саймон и соавторы. Вместо этого я просто приготовила среду на прекрасной ванкуверской водопроводной воде. (Вполне допустимый выбор для специалиста, тем более что микроэлементы содержатся и в реактивах, из которых готовили среды. — Е.К.) Я также не включила многие витамины, которые добавляли они, — у меня были маточные растворы тиамина и пантотеновой кислоты, и других витаминов я не добавляла. (Позднее нужные витамины получили и добавили в среду. — Е.К.)

26 июня. Почему GFAJ-1 гораздо лучше растут на агаре, чем на жидкой среде?

Один из милых сюрпризов, которыми полна работа микробиолога. На агаре в чашке Петри клетки росли даже лучше, чем у авторов оригинальной статьи, а в жидкой среде расти отказались!

Следующие две недели проходят в выяснениях причины. Может быть, все же не стоило использовать водопроводную воду, хоть другим бактериям она и не вредила? (Агаровую среду готовили на дистиллированной воде.) Или что-то нехорошее было в новеньких пробирках, в которые разливали среды? Чашки Петри замотали в парафиновую пленку, чтобы предотвратить высыхание, а пробирки были закрыты крышками без винта, допускающими циркуляцию воздуха, — может, в этом дело?.. Ни замена посуды, ни добавка недостающих витаминов и микроэлементов в среду не помогают.

Причина в итоге оказалась на самом виду. Оказалось, что клетки растут на агаре, однако не растут на более чистой агарозе. Агар, в отличие от агарозы, содержит ионы калия. Так вот, Волф-Саймон использовала в качестве источника Р фосфат калия, а Редфилд — фосфат натрия. Добавка хлорида калия исправила положение, но еще больше запутала ситуацию с результатами Волф-Саймон и соавторов. Когда они готовили среду без фосфора и с арсенатом, они брали арсенат натрия. И как теперь понять, от чего у них страдали клетки — от нехватки фосфора или калия?

Попутно выяснилось, что рост клеток резко ускоряет добавка аминокислоты глутамата в среду по Волф-Саймон. (Повлиять на результаты эта добавка не могла: аминокислоты не содержат фосфора.) В конце концов доктор Редфилд и ее будущие соавторы решили, что им удалось подобрать условия, позволяющие проверить существование мышьяковой жизни.

25 июля. Они растут...

«Два отличных предварительных результата:

Во-первых, GFAJ-1 отлично растут на жидкой среде с добавкой 10 мМ глутамата.

Во-вторых, они не растут, если я не добавляю в среду фосфат.

То и другое означает, что теперь у нас есть условия, чтобы проверить, могут ли эти клетки включать мышьяк в ДНК, если фосфата мало».

Пост украшает фотография, приятная глазу микробиолога: колбы со средой, прозрачной, как вода, где ничего не выросло, и одна, заполненная мутной бактериальной взвесью.

27 июля. Рост GFAJ-1 в условиях ограничения по фосфату. Доктор Редфилд сравнила, как растут клетки на среде, содержащей 1,5 мМ фосфата, и не содержащей его (если не брать в расчет примесей). Она сделала несколько повторностей — с разными исходными количествами клеток, причем использовала для начального посева клетки двух типов: одни взяла из богатой фосфором среды (то есть они успели накопить его про запас), другие — из бедной. Ничего удивительного, что при дефиците фосфора вторые перестали делиться раньше. Вот еще мелочь, о которой легко забыть: если человек, не страдающий истощением, голодает день- другой и остается живым, преждевременно делать вывод, что он перешел на питание праной...

29 июля. Уровень фосфата и контроли ДНК.

«ОК, похоже, мои опыты с мышьяковыми бактериями перешли от стадии "почему они не растут" к настоящей науке». Исходя из темпов роста клеток, автор приходит к заключению, что ее среда -Р содержит меньше фосфора, чем было у Волф-Саймон, и решает на будущее добавлять в «бесфосфорную» среду около 3 мкМ фосфата. Обсуждается приготовление под вытяжкой маточного 1 М раствора арсената натрия Na2HAsO4 («единственный по-настоящему опасный этап»). Также запланирован контроль на качество очистки ДНК: выдержать в мышьяковом растворе ДНК другой бактерии, а затем про- извести с ней те же операции по очистке. Если после этого контрольная ДНК будет «содержать мышьяк» — над очисткой препарата придется еще поработать.

1 августа опубликованы более подробные результаты по росту бактерий в бесфосфорной среде. Кстати говоря, рост на бесфосфорной среде оказался гораздо лучше, чем у Волф- Саймон, и вполне сравним с их же данными по росту на среде с мышьяком. Возникает вопрос: может быть, их среда «без фосфора и мышьяка» просто содержала меньше примесей фосфора, чем мышьяковая? (Возможно и другое объяснение: обитатели озера Моно используют мышьяк каким-то иным способом, не строя из него биомолекулы, и поэтому страдают от его отсутствия. Но все же следует сначала исключить более простые объяснения, например ту же нехватку калия.)

«Раствор арсената стоит на моем лабораторном столе, снабженный броской надписью "ЯД". Рядом большая бутылка для использованных сред — их нужно будет отправлять в нашу службу химических отходов для утилизации. Поставлю еще бутылку, чтобы собирать наконечники и другие твердые вещи, сильно загрязненные мышьяком».

Слайд, который Розмэри Редфилд приготовила для выступления на Science Foo Camp (август-2011) — серьезном, но в то же время и веселом междисциплинарном мероприятии

21 августа. Неоднозначный эффект 40 мМ мышьяка.

С добавкой мышьяка проблемы начинаются по новой.

Культуры с 40 мМ арсената, к которым не добавили фосфата или добавили 1,5 мМ, росли неохотно (если росли вообще), а вот культура с символической добавкой 3 мкМ фосфата в двух случаях продемонстрировала довольно быстрый рост, а в двух других расти отказались! Трудовые будни науки: невоспроизводимость по неясным причинам.

29 августа. Теперь они не растут на арсенате.

Упрямым бактериям купили новые пробирки, с завинчивающейся крышкой, чтобы все было в точности как у первооткрывателей. Безрезультатно. Поскольку доктор Редфилд уезжала в командировку, она оставила культуры в термостате, на случай если они будут расти очень-очень медленно. Но расти они не стали

Две недели спустя исследовательница собирается перепроверить все, что можно: всю стеклянную посуду мыть кислотой, тщательно промывать дистиллированной водой и после этого повторно автоклавировать, попробовать различные виды посуды — может, удастся добиться воспроизводимости?

17 октября. Нет роста при 40 мМ арсената НИ В КАКОЙ емкости.

«И прекрасный рост без мышьяка в любой емкости. (...) Это смешно. По-моему, у меня еще никогда не было таких бессовестно невоспроизводимых результатов. (...) Читатели, есть идеи?»

11 нобяря. Полипропиленовые пробирки=токсичность.

В стеклянной посуде удалось добиться воспроизводимости, а вот в полипропиленовых пробирках, наполненных средой с мышьяком, бактерии расти отказались.

18 ноября. ДНК! Много, много чудесной ДНК GFAJ-1!

«ОК, наконец я нашла условия, в которых GFAJ-1 воспроизводимо растет при 40 мМ арсената натрия: плотно закрытые стеклянные пробирки или колбы с колпачком на винте плавно покачивать при 37оС.

Печально, но факт: у меня нет никаких идей насчет того, почему клетки не растут в ПП-пробирках с винтом или во флаконах или почему они иногда не растут нигде. (...) Я вырастила большие объемы клеток в колбах и экстрагировала из них ДНК. Мои соавторы сказали, что им хотелось бы получить порядка 50 мкг ДНК для очистки в градиенте хлорида цезия и масс-спектрометрии. Для этого понадобится примерно 2*10¹⁰ клеток».

Высокомолекулярная ДНК, когда ее осаждают из водного раствора этиловым спиртом, имеет вид волокнисто-студенистого комка, который специалисты непочтительно называют «соплей» или «медузой». Ее можно собрать на дне пробирки центрифугированием и слить раствор, а можно просто вытащить, намотав на кончик пипетки. Волф-Саймон использовала первый метод, Редфилд предпочла второй: при центрифугировании вместе с ДНК мы соберем все нерастворимые примеси, и кто знает, как это отразится на результате?

1 января 2012 года. Готовимся к некоторым мышьяковым данным.

«Со дня на день ожидаю некоторые предварительные результаты масс-спектрометрии ДНК GFAJ-1 на содержание мышьяка. В ходе подготовки я должна хотя бы попытаться понять контрольные данные, которые мне прислал студент-выпускник, выполняющий эту работу (Маршалл Луис Ривз из Принстонского университета. — Е.К.). Но я отвлеклась на более легкую задачу: понять контрольные данные по градиенту в хлориде цезия, которые он тоже прислал. Этот этап предваряет анализ, он нужен для дополнительной очистки ДНК.

Что он сделал: контрольную ДНК (из клеток, выращенных на фосфатной среде без арсенатов) разделил в двух градиентах и собрал фракции (по 100 мкл из 1 или 2 мл). Он измерил количество ДНК в каждой фракции (получился хороший ДНК-пик). Затем он объединил пики с высоким содержанием ДНК, удалил из них хлорид цезия и переварил ДНК, готовя к масс-спектрометрии».

Центрифугирование в градиенте CsCl — важный метод разделения крупных молекул (белков, ДНК, РНК) по их плотности. Анализ градиента позволит также определить, в каких фракциях содержится мышьяк, если он будет вообще. Например, если он равномерно распределен во всех фракциях, значит, он находится в растворе, если в самых тяжелых — значит, в осадке, а если в тех же, что ДНК, — возможно, он ковалентно или нековалентно связан с ней.

11 января. Пишем статью о мышьяковой жизни.

«Выпускник, выполняющий масс-спектрометрию образцов ДНК, все еще проверяет, соответствуют ли они его высоким стандартам, но, как только они будут готовы, он отправит их мне, и я выложу их здесь. Однако поскольку он и его руководители пришли к выводу, что ДНК не содержит мышьяка, мы начали писать статью (...)

Но сначала мы должны повторить результаты. Я планирую создать несколько детальных кривых роста культур с раз- личным уровнем фосфатов и без 40 мМ арсената. Для этого я хочу использовать прибор BioScreen, который принадлежит соседней лаборатории. Этот прибор позволяет автоматизировать сбор данных об оптической плотности культур, растущих в планшете на 100 лунок. (Зависимость скорости роста от концентрации фосфата в целом подтвердилась. — Е.К.) Я также выращиваю клетки для новых препаратов ДНК, на тех же средах и в тех же условиях, что раньше. Это займет всего несколько дней, и я надеюсь, что в понедельник буду готова направить ДНК моим коллегам».

14 января. Получение заключительных данных.

Автор продолжает делать то, о чем писала в предыдущем посте, а также проводит дополнительный контроль, специально для одного малограмотного анонимного визитера: ставит электрофорез ДНК GFAJ-1, выращенной на среде с арсенатом и без, которая хранилась в холодильнике в водном растворе два месяца. Если ДНК содержит арсенаты, из-за легкости гидролиза она должна развалиться на куски. Однако никакой заметной глазом деградации электрофорез не показал, ни для двунитевой ДНК, ни для однонитевой.

16 января. Данные центрифугирования в CsCl-градиенте и масс-спектрометрии.

Результат масс-спектрометрии образцов ДНК бактерии GFAJ-1, якобы содержащей мышьяк. Каждая точка — это фракция в градиенте (один график для -As/-P, другой для +As/-P, обе среды содержали 3 мкМ фосфата). Линии с закрашенными точками показывают содержание ДНК во фракциях, с незакрашенными — содержание арсената. Легко видеть, что его нет нигде, в том числе и в ДНК. Пунктирная линия соответствует количеству арсената, которое было бы зарегистрировано, если бы предположение Волф-Саймон и соавторов о замене 4% фосфатов в ДНК арсенатами было верным

«Вот рисунок, который мне прислал выпускник: результаты ЖХ-МС (хроматомасс-спектрометрии) двух образцов ДНК из первого набора, который я посылала ему». Вопрос о мышьяке в ДНК закрыт.

Собственно, всё. Статья написана, принята на рассмотрение в журнале «Science», а с 1 февраля доступна для всех желающих (http://arxiv.org/abs/1201.6643, «Absence of arsenate in DNA from arsenate-grown GFAJ-1 cells», Marshall Louis Reaves, Sunita Sinha, Joshua D. Rabinowitz, Leonid Kruglyak, Rosemary J. Redfield). Да еще 3 февраля появилась запись: «Авторство без ответственности?» Хотелось бы услышать, пишет доктор Редфилд, что думают по поводу критики результатов Волф- Саймон и соавторов эти самые соавторы. Их 11 человек, и они по большей части отмалчиваются, предоставляя ведущему автору отдуваться в одиночку. «Возможно, они понимают свой вклад как работу по контракту — предоставили данные, стали авторами и умыли руки».

История на этом не кончается . «Science» пока не сообщил, принята ли статья к публикации (статья опубликована в «Science» от 27 июля 2012 года. - Примеч. в электронной версии), а первооткрыватели GFAJ-1 наверняка постараются придумать какие-то аргументы в ответ. И, помимо «закрытия» мышьяковой жизни, есть не менее важный вопрос: как будет развиваться в дальнейшем «открытая наука»? Станет ли больше блогов, подобных RRResearch, и что принесет науке этот новый формат представления информации, личный и непосредственный, как переписка, и при этом массовый, как публикация в большом журнале? Подождем обновлений...