Протонный цикл. История одного открытия из области биоэнергетики (Часть 1)

Прошлой осенью из Стокгольма пришло известие: Нобелевскую премию по химии дали Питеру Митчелу. Узнав об этом, звонит мне старый знакомый, поздравляет: «Прав, значит, Митчел!»

Для меня эта история началась четверть века назад, когда я, студентом третьего курса, занялся тем, что сейчас называют биоэнергетикой. Рискованная, в общем-то, область биологии: здесь ничего не увидишь, не уловишь на слух и не пощупаешь руками. Приходится доверять приборам, способным ловить слабые отклики событий, сопутствующих превращению энергии в мельчайших крупинках живой материи.

Здесь нет ничего сложнее, чем угадать единственный правильный путь среди тысячи, казалось бы, равных возможностей. И нет ничего проще, чем придумать новую гипотезу: достаточно располагать неким минимумом сведений и способностью логически мыслить.

Крепкий орешек

В 1961 году в Москве на Всемирном биохимическом конгрессе выступал с пленарной лекцией американец Дэвид Грин. Я слушал доклад со все возраставшим волнением. Казалось, еще шаг — и группа Грина в Мэдисоне решит проблему превращения энергии при дыхании и фотосинтезе. «Эту работу мы закончим к следующему конгрессу», — пообещал Грин. Можно ли сомневаться в его успехе?

Профессор Грин… Блестящий специалист по окислительным ферментам: ферментные комплексы, названные его именем, — излюбленный объект биоэнергетиков. Директор института энзимологии в университете штата Висконсин, с его сказочно дорогим оборудованием и неправдоподобными масштабами работы. Там рядами стоят десятки ультрацентрифуг, там за один день перерабатывают сотни килограммов бычьих сердец, а за сердцами посылают на чикагские бойни специальный самолет. Вот кто такой профессор Грин!

Прошло три года. Вновь — конгресс биохимиков. Председательствующий Э. Слейтер дает слово Дж. Уэбстеру для внеочередного сообщения чрезвычайной важности. Уэбстер — правая рука Грина. Должно быть, Грин выполнил свое обещание? Так и есть: Уэбстер сообщает об успехе решающего эксперимента.

Это — торжество Грина и, казалось бы, хороший повод для других биоэнергетиков сменить тему. Но стоит ли спешить, особенно если вы, подобно Э. Ракеру из Корнелльского университета, что в Итаке, посвятили биоэнергетике не один год своей жизни? Ракер решает повторить опыты Уэбстера и сразу, в самом начале работы, обнаруживает небольшое несоответствие: один из белков в Итаке движется на электрофоре- грамме не так, как в Мэдисоне. Ракер звонит Грину, чтобы поделиться своими сомнениями. Тот и слушать не хочет: какие там еще несоответствия? «Мой Уэбстер прав и точка!» Ракер задет за живое: своим глазам он верит больше, чем всей армии гриновских сотрудников.

И вот Ракер в Мэдисоне. Грин продолжает упорствовать. Ракер просит показать ему электрофореграмму. Грин посылает за Уэбстером. Тот появляется и, узнав о причине вызова к шефу, уходит в соседнее здание за протоколами опытов… Уходит и — не возвращается. Более того, профессор Джордж Уэбстер исчезает! Его не могут разыскать ни в лаборатории, ни дома, ни у коллег по институту. Грин в замешательстве. В конце концов и без помощи Уэбстера он находит-таки протоколы и шаг за шагом проверяет результаты опытов. И тут всплывает чудовищный факт: в решающем измерении радиоактивности, когда определялось включение меченого фосфата в органическую фракцию, налицо явный разброс данных. При этом в опытных пробах (где ожидали включение фосфата) дальнейший расчет ведется по максимальным величинам, а в контроле (где включения фосфата быть не должно) — по минимальным. Разность тех и других величин записывается в итог опыта и преподносится как его окончательный результат.

…Спустя месяц Уэбстер объявится в другом конце США, в Майами, и напишет Грину невразумительное письмо в свое оправдание, а еще спустя несколько недель Грин сделает сообщение на съезде американских биохимиков и разошлет его текст своим вчерашним конкурентам-биоэнергетикам. Название доклада — «О вкладе Джорджа Уэбстера в изучение дыхательного фосфорилирования». Это — чистосердечное признание в невольном обмане, на который толкнул его сотрудник-фальсификатор. Но раскаяние не спасет профессора Грина. С тех пор ни один серьезный журнал не примет его статьи, и Грин будет публиковаться только в трудах Национальной академии наук (США), где он как академик защищен от критики рецензентов.

Казалось бы, жестокий и наглядный урок! Но как бы это ни показалось невероятным, история Грина и Уэбстера . повторяется спустя несколько лет. На этот раз другой почтенный биоэнергетик, профессор Хантер, становится жертвой недобросовестности своей аспирантки, мисс Пэйнтер, пытавшейся провести все тот же «роковой» эксперимент с включением фосфата.

Не подумайте, что биоэнергетика богаче проходимцами, чем любая другая наука. Просто в развитии каждой науки когда-то наступает свой звездный час, приближение которого лихорадит даже самые холодные и расчетливые умы. Так случилось с биоэнергетикой в шестидесятые годы.

В те времена звездный час переживали молекулярные биологи. Уже открыли двойную спираль ДНК. Шумно отпраздновали победу над тайной генетического кода. Расшифровали пространственную структуру первых ферментов. А вот биоэнергетики, не уступавшие «нуклеинщикам» и энзимологам в своих честолюбивых мечтах, все еще не могли ответить на вопрос, каким таким образом живая клетка обеспечивает себя необходимой энергией. Такая ситуация каралась тем более странной, что давно уже были налицо, казалось бы, все предпосылки для решения этой проблемы. Стало ясно, какими энергетическими ресурсами пользуются те или иные живые существа. Были найдены и получены в чистом виде ферменты, усваивающие эти ресурсы. Не составило большого труда определить, в каких частях клетки происходят энергетические превращения. Однако сам принцип, на котором базируется действие основных биологических преобразователей энергии, оставался неясным, как и прежде.

Здесь я должен извиниться перед читателем: мне придется сообщить кое-какие специальные сведения, которые могут показаться скучными. Но к сожалению, без них не понять все дальнейшие перипетии этой истории, подобно тому как в детективном романе не обойтись без описания места происшествия.

Так вот, биохимикам известно, что живая клетка превращает энергетические ресурсы (например, пищевые вещества) в субстрат определенного окислительного фермента. Фермент катализирует окисление этого субстрата (назовем его АН₂) каким-либо другим веществом (В). Выделяющаяся при окислении энергия используется для синтеза аденозинтрифосфата (АТФ), компонента, играющего роль универсального поставщика энергии при различных видах работы живого организма. Было показано, что АТФ получается путем соединения неорганического фосфата с предшественником АТФ, аденозиндифосфатом (АДФ):

АН₂ + В + АДФ + H₃PO₄ = А + ВН₂ + АТФ + H₂O.

Невероятно, чтобы такая химическая реакция происходила в одну стадию: это потребовало бы одновременного взаимодействия всех четырех веществ, написанных в левой части уравнения. Поэтому приходится предположить, что процесс протекает с участием фермента в несколько этапов. Например:

АН₂ + фермент → АН₂ — фермент
АН₂ — фермент + В → А — фермент + ВН₂
А — фермент + Н₃РО₄ → А — фосфат + фермент
А — фосфат + АДФ → А + АТФ

Именно так образуется АТФ при брожении. Брожение — «подсобный» механизм энергообеспечения. Он включается в условиях нехватки основных энергетических ресурсов: у растений — света, у животных и бактерий — кислорода или окисляемых кислородом веществ (субстратов дыхания). В общем-то, не удивительно, что механизм образования АТФ при дыхании и фотосинтезе вначале стремились объяснить по аналогии с уже изученным к тому времени брожением. Казалось, замени бродильный фермент на дыхательный или фотосинтетический, и та же система реакций будет образовывать АТФ за счет световых квантов или питательных веществ, сжигаемых кислородом.

Эта точка зрения, названная «химической схемой», стала общепринятой концепцией биоэнергетики в пятидесяые — шестидесятые годы. В ее основе — хорошо известные факты, свидетельствующие о ключевой роли окислительных ферментов в дыхательном и фотосинтетическом синтезе АТФ. Но что это за роль? Казалось бы, ясно: катализ окислительных реакций и их сопряжение с синтезом АТФ. Поэтому во многих лабораториях предпринимались отчаянные усилия заставить ферменты дыхания и фотосинтеза реагировать с АДФ и фосфатом, как того требовала схема.

Биоэнергетики шли дорогой, уже пройденной однажды при изучении брожения. Сперва разрушали структуру клетки, потом из великого множества внутриклеточных ферментов выделяли тот, который катализировал нужную окислительную реакцию. И наконец, к раствору очищенного фермента добавляли субстрат, вещество-окислитель, АДФ и фосфат, и смотрели, не получится ли АТФ.

Так вот, АТФ не получался!

Напрасно искусные экспериментаторы составляли сложнейшие смеси белков, субстратов и солей, варьируя до бесконечности условия проведения реакции. С легкостью удавалось воспроизвести в пробирке окислительный процесс, но освобождающаяся энергия превращалась в тепло вместо того, чтобы использоваться для синтеза АТФ. Сообщения о синтезе АТФ в растворе дыхательных ферментов всегда оказывались в конце концов случайной ошибкой или преднамеренной фальсификацией, как это было с Уэбстером и Пэйнтер.

В то же время более сложные системы, сохранявшие черты надмолекулярной организации биологических объектов: кусочки тканей, клетки, внутриклеточные органеллы (митохондрии и хлоропласты) — или даже образующиеся при их разрушении ультразвуком мельчайшие пузырьки, окруженные мембраной,— все они в определенных условиях образовывали АТФ. Но стоило изменить условия — и даже на этих сложных объектах дыхание утрачивало связь с синтезом АТФ.

Уже первые исследователи, работавшие с дыхательным синтезом АТФ, обратили внимание на ту необычайную легкость, с которой фосфорилирование ускользает, а дыхание переключается на «холостой ход». Сопряжение дыхания с фосфорилированием обнаружил Владимир Александрович Энгельгардт в 1930 г. А спустя несколько лет другой Владимир Александрович, Белицер, описал условия, когда дыхание отключалось от фосфорилирования и протекало без образования АТФ, несмотря на высокую скорость окислительной реакции. Так было открыто явление, названное разобщением дыхания и фосфорилирования. Именно этот эффект оказался камнем преткновения для химической схемы биоэнергетики.

Парадокс веществ-разобщителей

Тот факт, что окисление может быть отключено от фосфорилирования, впервые был описан при изучении брожения. Если сбраживать сахар в среде, где .фосфат заменен на арсенат, то брожение идет с большой скоростью, но без образования АТФ. Подобным образом действует арсенат и на дыхание: в присутствии арсената система дыхания перестает запасать энергию в форме АТФ. Именно арсенат был первым разобщителем дыхания и фосфорилирования в опытах В.А. Белицера. Казалось бы, это наблюдение лишь подчеркнуло еще раз сходство механизмов дыхания и брожения, чего и требовала химическая схема.

Осложнения начались с 1948 г., когда Ф. Липман неожиданно обнаружил, что дыхание разобщается и таким веществом, как динитрофенол, причем его требуется гораздо меньше, чем арсената. В отличие от арсената динитрофенол совсем не похож на фосфат. Фермент может принять арсенат за фосфат, но чтобы он перепутал фосфат с динитрофенолом?.. Кстати, динитрофенол не действовал на брожение, и это могло бы зародить сомнения в сходстве механизмов дыхательной и бродильной энергетики.

Несколько лет эффект Липмана считали одним из курьезов, которыми не так уж бедна биохимия. Однако затем последовали наблюдения, показавшие, что разобщить дыхание и синтез АТФ можно не только динитрофенолом, но и салициловой кислотой, дикумаролом, перфторпинаколом, производными бензимидазола и фенилгидразона.

…Теперь, рассказывая студентам историю о разобщителях, я пишу формулы этих веществ (рис. 1) на доске в конце первого часа лекции и предлагаю подумать о том, что же роднит разобщители между собой и почему все они одинаково действуют на дыхание. Наиболее смышленым хватает пятнадцати минут перерыва между лекциями, чтобы найти правильный ответ. Науке для этого потребовалось больше пятнадцати лет. От частного, в общем-то, вопроса о действии веществ-разобщитепей биоэнергетики пришли к одному из крупнейших открытий современной биологии, справедливо отмеченному Нобелевской премией.

Что же, пора представить читателям лауреата, чья фигура по праву заняла центральное место в биоэнергетике шестидесятых — семидесятых годов.

1. Формулы разобщителей

Питер Митчел. Начало пути

Питер Деннис Митчел* родился 29 сентября 1920 г. в Митчепе (графство Суррей, Англия). Сын лейтенанта британской армии был отдан родителями в Тонтонский королевский колледж. Затем — студент колледжа Иисуса в Кембриджском университете. В 1943 г. — выпускник университета, бакалавр искусств. В том же году Митчел начинает работать над диссертацией под руководством профессора Д.Ф. Даниэлли. Еще в тридцатые годы Даниэлли прославился как автор изящной концепции о молекулярном строении биологических мембран — тончайших пленок, окружающих цитоплазму любой живой клетки или ее органеллы. После отъезда Даниэлли из Кембриджа Митчел переходит в группу по изучению ферментов, которую возглавлял известнейший энзимолог М. Диксон.

Чтобы стать кандидатом наук (в Англии это называется «доктор философии»), Митчелу потребовалось семь лет. Вторую диссертацию — на звание доктора наук — Митчел так и не защитил, шагнув в 1974 г. сразу в члены Королевского общества.

Студентом Митчелу довелось слушать лекции Флеминга. Это было время, когда из английских госпиталей выходили

фронтовики, чью жизнь спас Флемингов пенициллин. И в общем-то, не удивительно, что темой своей первой научной работы молодой биолог выбрал механизм действия пенициллина на бактерии.

Сначала было исследовано включение меченого фосфата в нуклеиновые кислоты. Пенициллин тормозил этот процесс. В столь сложной системе, как живая клетка, такой эффект мог объясняться либо прямым действием пенициллина на синтез нуклеиновых кислот, либо влиянием на какой-то отдаленный этап обмена веществ или на перенос фосфата через клеточную стенку.

Именно тогда Митчел впервые уловил притягательную силу тайны, окружавшей роль фосфата в энергетике клетки. Но пройдут годы, прежде чем он вплотную займется этой проблемой. Пять лет после защиты диссертации Митчел работает демонстратором на кафедре биохимии Кембриджского университета, а затем его приглашают старшим преподавателем на кафедру зоологии в Эдинбург. В течение следующих восьми лет, проведенных здесь, в Шотландии, Митчел мало печатается, не спешит с продолжением опытов по действию пенициллина. Постепенно он приходит к убеждению, что история с пенициллином — всего лишь частный случай, за которым стоят куда более общие вопросы.

Митчел как-то издалека, медленно, исподволь приближается к основной проблеме биоэнергетики. Сначала — мысль о том, нельзя ли отнести пенициллин к загадочным разобщителям, благо в эту группу попадают самые разные по строению вещества. Казалось бы, взять да поставить опыт вроде того, что описал Липман еще в 1948 г.! Но далеко ли он продвинется вперед, если даже докажет, что пенициллин действительно разобщитель? Одним разобщителем больше — не велико открытие! Не лучше ли поразмыслить над тем, что такое вообще разобщение дыхания и фосфорилирования? Ясно, что здесь дело в каком-то нарушении механизма, сопрягающего эти два процесса. А что это за сопрягающий механизм?

Митчел внимательно анализирует бытовавшие в то время взгляды на природу дыхательного фосфорилирования. На первый взгляд ему, биохимику, должна импонировать химическая схема сопряжения, объяснявшая энергетику дыхания наподобие уже известной энергетики брожения. Но как объяснить действие разобщителей? Интуиция энзимолога (недаром Диксон — один из его учителей!) подсказывала Митчелу, что динитрофенол и вся разномастная компания разобщителей не могут быть аналогами фосфата. Ферменты слишком разборчивы к своим субстратам, чтобы ошибаться так грубо.

Но что если разобщители действуют не на фермент, а на его окружение?

Дыхательные ферменты отличаются от ферментов брожения тем, что они не плавают в клеточном соке, а прикреплены к мембранам. Так может быть именно мембрану и атакуют разобщители? Но зачем нужна мембрана ферментам вообще и дыхательным ферментам в частности? Вот. вопрос, которым занялся Митчел, вспомнив беседы с другим своим учителем — Даниэлли, основателем учения о мембранах. [О Питере Митчеле см. также статью «Питер Митчелл: как заряжаются биологические аккумуляторы» (2020 №9)]

Биохимики и «транспортники»

До Митчела биохимики, изучавшие мембранные ферменты, рассматривали мембрану как штатив, к которому эти ферменты крепятся. Считалось, что ферментативные процессы развертываются на поверхности, а не в «толще» мембраны. Такое мнение основывалось на факте, что субстраты ферментов — это, как правило, водорастворимые вещества. Казалось бы, они не должны проникать в сердцевину мембраны, сделанную из жира.

Однако для целой группы процессов транспорта веществ было установлено с несомненностью, что водорастворимые соединения проходят каким-то образом через жировой барьер мембраны внутрь клетки. Если, допустим, глюкоза, вообще не растворимая в жирах, переносится через внешнюю мембрану клетки (а это факт!), почему бы не предположить, что она может быть атакована каким-то из мембранных ферментов не на поверхности, а в срединной части мембраны?

До Митчела химическими превращениями внутри мембран практически не занимались. Изучение транспорта через мембраны оставалось уделом физиологов-«транспортников». Биохимики рассматривали мембрану как помеху, от которой следует поскорее избавиться, чтобы перевести исследуемый фермент в раствор и там уже заняться им вплотную, используя весь арсенал энзимологии.

Столкнувшись с проблемами биоэнергетики, Митчел был поражен отсутствием каких бы то ни было контактов биохимиков с «транспортниками». Между ними лежала пропасть. И Митчел занялся наведением мостов.

Чисто умозрительное построение

Представим себе на момент такую схему. Стакан с водой разделен на две части перегородкой. В перегородке — отверстие, закрытое мембраной. В мембрану встроен фермент, превращающий какое-либо вещество (субстрат) в продукт. Фермент закреплен в мембране таким способом, что он связывает субстрат из раствора слева от мембраны и освобождает получающийся продукт в раствор справа от мембраны. Если теперь добавить в каждый из растворов равные количества субстрата и продукта, то спустя какое-то время в левом отсеке резко понизится концентрация субстрата, а в правом — повысится концентрация продукта. При этом окажется, что энергия, выделяющаяся в ходе ферментативной реакции, будет использована на повышение концентрации веществ в правом отсеке в сравнении с левым.

Работа, затраченная на концентрирование веществ, называется осмотической. Поэтому система на рис. 2 — не что иное, как химико-осмотический преобразователь, поскольку химическая энергия, выделяющаяся при реакции, тратится на осмотическую работу.

2. Схема химико-осмотического преобразователя энергии. Два раствора одинакового состава разделены мембраной. В мембране — фермент, превращающий вещество-субстрат в продукт, что сопровождается выделением энергии. Мембрана так устроена, что фермент может связать субстрат только на левой, а освободить продукт — только на правой ее поверхности, т.е. для освобождения продукта в раствор необходим поворот фермента в мембране на 180°

В принципе такой преобразователь может действовать обратимо. Например, повышение концентрации продукта в правом отсеке стимулирует дальнейшее превращение этого продукта, если он атакуется другим ферментом на правой стороне мембраны.

Если один фермент окисляет субстрат кислородом, а другой синтезирует АТФ из АДФ и фосфата и оба они закреплены в одной и той же мембране, то нельзя ли сопрячь окисление и фосфорилирование по принципу, описанному выше? Для этого потребовалось бы, чтобы окислительный фермент переносил через мембрану АДФ и фосфат или образовывал какой-то продукт, используемый в реакции синтеза АТФ.

В обширной литературе по дыхательному фосфорилированию не было никаких указаний на то, что дыхательные ферменты действуют как переносчики АДФ и фосфата через мембрану. Но только ли АДФ и фосфат участвуют в данной реакции и только ли АТФ образуется в ее результате? На первый вопрос мы смело можем ответить утвердительно. Что касается второго, то надо признать, строго говоря, существование, помимо АТФ, еще одного продукта, хотя и незначительного по величине. Этот продукт — молекула воды. Давайте рассмотрим реакцию синтеза АТФ:

ADPOH + HOP → ADPOP + Н₂О.

Молекула Н₂О при синтезе АТФ, обозначенного здесь ADPOP (буквами Р показаны атомы фосфора), может получиться из остатка гидроксила (ОН), отщепляемого от фосфата (обозначенного НОР), и иона водорода аденозиндифосфата (ADPOH).

Вода — продукт не только синтеза АТФ, но и дыхания, которое формально описывается реакцией взрыва гремучего газа:

2Н₂ + О₂ → 2Н₂О,

с той разницей, что в процессе участвует не молекулярный водород, а органические субстраты, поставляющие атомы Н для образования воды.

Если две реакции, образующие общий продукт, протекают в одной пробирке, то они в конце концов могут лишь замедлить друг друга. В то же время наша цель — объяснить, почему дыхание активирует, увлекает за собой реакцию фосфорилирования. Итак, введя в поле нашего зрения воду, мы все еще не продвинулись к цели? Так-то оно так, да не совсем. Появилась маленькая зацепка, ниточка, потянув за которую, можно попытаться распутать клубок.

Нам нужно, чтобы дыхание влияло на фосфорилирование, и эта цель уже достигнута — влияние уже есть. Беда только в том, что влияние-то направлено не в ту сторону, куда хотелось бы. Но ведь мы не учли еще один непременный компонент системы — мембрану. Плохо, если вода, образующаяся при дыхании, и вода, образующаяся при синтезе АТФ, выделяется по одну и ту же сторону от мембраны, то есть в один и тот же отсек. Это равносильно протеканию двух реакций в одной пробирке. А что если два процесса образуют воду по разные стороны от мембраны? Тогда дыхание будет создавать избыток воды, образуя ее, например, слева от мембраны. Допустив теперь, что синтез АТФ приводит выделению воды справа от мембраны, мы создадим ситуацию, когда синтез АТФ как бы компенсирует нехватку воды справа относительно возросшей (из-за дыхания) «концентрации воды» слева. Тем самым, в принципе говоря, тормозящее влияние дыхания на фосфорилирование сменяется благоприятным эффектом: дыхание создает избыток продукта (воды) по одну сторону мембраны, а фосфорилирование уравнивает «концентрацию воды», образуя ее по другую сторону мембраны. Уравнивание концентраций повышает энтропию системы, и, стало быть, увеличивается вероятность процесса, вызывающего это возрастание энтропии. Дыхание повышает вероятность реакции синтеза АТФ. Другими словами, дыхание сопрягается с фосфорилированием. Наконец-то!

Гипотеза всегда основывается на предположениях. Она может быть отвергнута, если хотя бы одно из предположений противоречит уже известным фактам. Нет ли таких противоречий в «водной» гипотезе сопряжения? К сожалению, есть. В предложенной схеме дыхание образует, а фосфорилирование нивелирует, разность «концентраций воды». Чтобы такая система работала, мембрана должна быть непроницаемой для воды. Если мы не выполним этого условия, то избыток воды, образуемый слева от мембраны за счет дыхания, «утечет» на другую ее сторону, где воды меньше. В результате «концентрация воды» слева повысится без всякого фосфорилирования, и энергия будет безвозвратно потеряна.

Так вот, давно известно, что биологические мембраны проницаемы для воды. Они вообще не могут служить барьером для маленьких нейтральных молекул. Поэтому у мембран нет шансов удержать разность «концентраций воды», даже если дыхание ее образует.' Умозрительное построение «водяной гипотезы» рушится!

Но может быть, из тех же блоков удастся построить что-нибудь более устойчивое?

Хемиосмотическая гипотеза

На чем же мы споткнулись? На том, что мембрана — негодный барьер для воды, продукта дыхания и фосфорилирования. Но из чего получится вода, например, при фосфорилировании? Из Н⁺, отнятого от АДФ, и ОН^– отнятого от фосфата. Так ведь Н⁺ и ОН^– — заряженные частицы, ионы, а для ионов мембраны, как правило, практически непроницаемы!

Итак, первое, что нам требуется, это чтобы синтез АТФ давал не воду, а ионы Н⁺ и ОН^–, разделенные мембраной.

Если бы теперь дыхание тоже образовывало не воду, а Н⁺ и ОН^–, то можно было бы так расположить ферменты в мембране, чтобы при дыхании ион Н⁺ выделялся слева от мембраны, а при фосфорилировании — справа от нее. Тогда окажется, что дыхание образует слева от мембраны кислоту, справа — щелочь, а процесс фосфорилирования просто нейтрализует эту кислоту и щелочь.

Таким образом, реакция нейтрализации кислоты и щелочи, образованных дыханием, окажется движущей силой процесса синтеза АТФ, а разность концентраций водородных ионов — фактором, сопрягающим дыхание и фосфорилирование.

Чтобы завершить строительство «интеллектуального собора», остается лишь придумать, как заставить дыхание образовывать кислоту и щелочь.

Известно, что окисление субстратов дыхания кислородом катализируется дыхательными ферментами. Они бывают двух типов. Одни присоединяют атомы Н, другие присоединяют электроны. Если окислить донор водорода (АН₂) ферментом — акцептором электронов (С), то одним из продуктов реакции окажутся ионы Н⁺:

АН₂ + 2С → А + 2Cē + 2Н⁺.

Если теперь восстановить кислород посредством Сē, то получатся ионы ОН^–:

2Сē + О₂ + 2Н⁺ → 2С + 2ОН^–.

3. Хемиосмотическая гипотеза Митчела. Окисление субстрата АН2 (реакция 1) ферментом-акцептором электронов (не указан, чтобы не усложнять схему) происходит на левой поверхности мембраны. В результате электроны присоединяются к ферменту, а протоны уходят в воду. Затем электроны переносятся ферментом на правую сторону мембраны и там восстанавливают молекулярный кислород или какой-либо другой акцептор водорода (в общей форме обозначен буквой В). Вещество В, присоединив электроны, связывает иоиы Н+ справа от мембраны, превращаясь в BH2 Синтез АТФ (реакция 2) происходит таким образом, что два иона Н+ отщепляются от АДФ и фосфата справа от мембраны, компенсируя потерю двух Н+ при восстановлении вещества В. Одни из кислородных атомов фосфата переносится на другую сторону мембраны и, присоединив два иона Н+ из левого отсека, образует Н2О. Остаток фосфорила присоединяется к АДФ, давая АТФ

По Митчелу, роль дыхания в синтезе АТФ ограничивается созданием избытка Н⁺ на одной стороне мембраны (на рис. 3 слева) по сравнению с другой ее стороной. Дыхание как бы сгущает, концентрирует иона Н⁺ в одном из двух отсеков системы, разделенных мембраной (реакция 1 на рис. 3). Иными словами, оно совершает осмотическую работу. Затем осмотическая энергия, накопленная в виде разности концентраций ионов Н⁺ между левым и правым отсеками, расходуется на химическую работу, т.е. на синтез АТФ (реакция 2).

Вот почему Митчел назвал свою схему «хемиосмотической гипотезой». Она выгодно отличалась от старой, «химической» схемы по крайней мере в одном своем аспекте. Митчел обошелся без неуловимых промежуточных продуктов вроде АН₂ — фермент, А — фермент и А — фосфат. Ему вообще не нужны были какие-либо специальные продукты, общие для реакций дыхания и фосфорилирования. По Митчелу, связующим звеном двух процессов служат водородные ионы.

Итак, хемиосмотическая гипотеза была свободна от одного из недостатков старых схем. В то же время она объясняла два ранее непонятных момента: необходимость мембран и механизм действия веществ-разобщителей. Совершенно очевидно, что устройство, придуманное Митчелом, нуждается в двух пространствах, разделенных мембраной, непроницаемой для ионов Н⁺ и ОН^–. Любое нарушение изолирующих свойств мембраны, например повышение ее проницаемости для Н⁺, то есть протонной проводимости, должно подавлять процесс синтеза АТФ. Что касается дыхания, то при повышении проводимости оно ускорится, так как перенос электронов, уже не приводящий к накоплению энергии, «покатится под гору», превращая всю энергию дыхания в тепло.

Так ведь это же и есть разобщение дыхания и фосфорилирования: тот самый феномен, над объяснением которого бились авторы «химических» гипотез, заставляя динитрофенол уподобиться фосфату в реакции с ферментом!

Митчел обратил внимание на то, что все разобщители являются растворимыми в жирах слабыми кислотами, то есть имеют в своем составе легко отщепляющийся протон (в формулах разобщителей, приведенных выше, он выделен жирным шрифтом). Так возникло предположение, что разобщители служат переносчиками протонов через мембрану: протонируются на той ее стороне, где дыхание создает избыток ионов Н⁺ затем диффундируют, неся лишний протон, через мембрану и освобождают Н⁺ в противоположном отсеке, где водородные ионы в дефиците.

Корни гипотезы

Пожалуй, только два факта (оба негативного свойства!) были положены Митчелом в основу его гипотезы в далеком уже 1961 г. Это — невозможность найти химические продукты, которые были бы общими для дыхания и фосфорилирования, и необъяснимость роли мембран и действия разобщителей в рамках традиционных представлений, почерпнутых из аналогий с брожением.

Однако было бы ошибочным полагать, что хемиосмотическая гипотеза возникла совсем уж на пустом месте. Еще в 1939 г. Г. Лундегард писал о возможности образования кислоты и щелочи мембранными окислительными ферментами. Лундегард был первым, кто «уложил» дыхательный фермент поперек мембраны, увидев в этом механизм концентрирования ионов. В сороковые годы эту идею подхватили И.Дж. Конвей и Т.К. Брэйди, а в начале пятидесятых — Р.И. Дэви, А.Г. Огстон и Г. Кребс.

Выдвинув гипотезу о разделении Н⁺ и ОН^– при синтезе АТФ, Митчел заполнил недостающее звено, замкнул «протонный цикл» и объяснил природу сопряжения между дыханием и фосфорилированием.

Окончание см. в №11

Член-корреспондент АН СССР
В.П. Скулачев