Дрожжи бродят в молоке

Художник: Макс Эрнст

Весной все оживает. В растениях появляются сладкие соки, в коровах и овцах — молоко, а в молоке — дрожжи. И неудивительно. Дрожжи — известные сладкоежки и любой сахар превращают в спирт. Бактериям спирт вреден, а людей он радует, поэтому продукты дрожжевого брожения оценили во всех концах мира. Так дрожжи прижились в средах, созданных человеком: вине, пиве и сброженных молочных продуктах (кефире, сырах, кумысе).

Естественно, к новым условиям пришлось приспосабливаться. Пивные дрожжи, например, научились усваивать специфичный для пива сахар мальтотриозу, состоящий из трех молекул глюкозы. Винные дрожжи приобрели устойчивость к медному купоросу и бордоской смеси, которыми обрабатывают виноградники, и к сульфитам, консервирующим вино. Это существенные изменения, однако они ничто по сравнению с тем, на что пошли молочные дрожжи. Ради любви к молоку они фактически изменили своим принципам.

Принципы сахаромицетов

Самые известные и распространенные одомашненные дрожжи Saccharomyces cerevisiae и их дикие родственники предпочитают глюкозу. Если предложить им смесь сахаров, то сначала дрожжи съедят глюкозу и только потом примутся за остальные углеводы.

Глюкоза — лучший источник АТФ, поэтому желающих поживиться этим сахаром много и конкуренция за нее жесткая. Какие только микроорганизмы не вырастают на сладкой капельке! Приходится S. cerevisiae бороться с конкурентами. Способ, который они для этого избрали, довольно традиционный: соседей зашугать, а самим быстро-быстро есть. Обычно дрожжи превращают глюкозу в спирт при недостатке кислорода. Если кислорода много, из глюкозы образуются углекислый газ и вода. Так ведут себя дрожжи, живущие на поверхности плодов или на коре дерева, орошенной соком. В 1927 году английский биохимик Герберт Грейс Кребтри обнаружил, что при большом количестве глюкозы S. cerevisiae, несмотря на аэробные условия, все равно образуют спирт. Сладость стимулирует брожение. Этот феномен так и назвали — эффект Кребтри. Поскольку глюкозы в среде много, брожение в сладких средах происходит быстро и концентрация спирта в них резко возрастает. Спирт токсичен для бактерий, посягающих на глюкозу, они погибают, и дрожжи могут беспрепятственно лакомиться, благо выдерживают гораздо большую концентрацию этанола. По-видимому, эффект Кребтри развился у дрожжей 125—150 миллионов лет назад, когда появились цветковые растения, наполненные сладким соком. Такая стратегия позволяла отвоевать у многочисленных бактерий нектар, однако она себя не оправдывает, если дрожжи выбирают для жительства молоко.

Начнем с того, что в молоке нет свободной глюкозы. Она там присутствует в составе дисахарида лактозы, а дрожжи едят только моносахара. Чтобы расщепить лактозу на галактозу и глюкозу, нужен фермент лактаза (бета-галактозидаза), которого у S. cerevisiae нет. Зато он есть у молочнокислых бактерий Lactobacillus, и дрожжи в молоке соседствуют с лактобациллами. Но если они будут, по своему обыкновению, отнимать у лактобацилл глюкозу и притравливать их спиртом, то останутся без помощников. Некому будет расщеплять лактозу, и дрожжи умрут с голоду. Поэтому молочные штаммы S. cerevisiae отказались от преимущественного потребления глюкозы в пользу лактобацилл, а сами переориентировались на менее востребованное соединение, галактозу.

Легко сказать — уступить глюкозу соседу, а как это сделать? Чтобы дрожжевая клетка могла потребить сахар (любой), она должна затащить его из окружающей среды внутрь через клеточную мембрану. Эту функцию выполняют особые белки-транспортеры (пермеазы). Если S. cerevisiae не хотят питаться глюкозой, проще всего не пускать ее в клетку. И молочные штаммы избавились от специфичных глюкозных транспортеров, а вместо этого обзавелись очень активным транспортером галактозы. Чтобы он эффективнее работал, ген этого белка удвоен. Но транспортерами дело не ограничилось.

Обычно S. cerevisiae используют галактозу как резервный сахар, поскольку растут на ней гораздо медленнее, чем на глюкозе. Это неудивительно. Ведь галактозу, как любой моносахарид, перед употреблением нужно превратить в глюкозо-6-фосфат (см. рисунок), что требует дополнительного времени и работы пяти ферментов. Гены, позволяющие сахаромицетам расти на галактозе, обычно не работают и включаются лишь тогда, когда глюкоза кончается, а галактоза появляется. Незачем клетке синтезировать белки, которые она не использует.

Прежде чем дрожжи сделают из сахара спирт, они превращают его в глюкозо-6-фосфат

Галактозные гены молочных сахаромицетов работают, во-первых, существенно активнее, а во-вторых, постоянно, даже когда галактозы в среде нет. Это объяснимо. Дрожжи, живущие на молочных фермах, на стенках сосудов, куда время от времени вливают молоко, должны быть готовы в любую минуту получить новую порцию. Промедление может стоить им жизни, потому что, пока дрожжи будут раскочегаривать синтез нужных ферментов, конкурирующие микроорганизмы сожрут всю лактозу, и S. cerevisiae погибнут от голода. Молочные штаммы S. cerevisiae растут на галактозе значительно лучше, чем винные или пекарские. По-видимому, они получили свой эффективный набор галактозных генов от родственных видов сахаромицетов в результате межвидовой гибридизации. Такая передача называется интрогрессией.

Переход на преимущественно галактозное питание не означает, что молочные сахаромицеты вообще отказались от глюкозы. Галактозная пермеаза хоть и с малой эффективностью, но поставляет глюкозу в дрожжевую клетку. Когда галактоза закончится, молочные дрожжи смогут воспользоваться глюкозой.

Итак, чтобы избежать конкуренции с бактериями-помощниками, дрожжи отказались от преимущественного потребления глюкозы и пошли на существенную перестройку генома. Они распростились с двумя генами глюкозных пермеаз, приобрели новые гены, необходимые для галактозного метаболизма, и один из них удвоили. Столько усилий, чтобы прижиться на молоке!

Где это случилось, точно неизвестно. Молочные штаммы S. cerevisiae встречаются по всему Старому Свету, от Казахстана до Франции и Марокко. По мнению французских, испанских и португальских исследователей, они произошли от природных популяций, живущих на коре средиземноморских дубов. А китайские ученые убеждены, что центр одомашнивания дрожжей, в том числе молочных, находится в Китае. Ну ладно, не в Китае, но уж на Дальнем Востоке точно. Там уже несколько тысяч лет делают кумыс.

Молоко стало обычным продуктом около десяти тысяч лет назад, когда люди перешли от собирательства к сельскому хозяйству. Его становилось все больше, в нем до 4% лактозы, и освоение такой ценной питательной среды, безусловно, стоило затраченных усилий. Меж тем другие дрожжи, клюйверомицеты, научились любить молоко ценой меньших жертв.

Приказано расщепить

Клюйверомицеты и сахаромицеты — родственники настолько близкие, что их долго относили к одному роду. Только в 1956 году Kluyveromyces выделили в отдельный род, названный в честь голландского биохимика и микробиолога Альберта Яна Клюйвера. Туда попали шесть видов, два из которых, K. marxianus и K. lactis, замечательны своей способностью самостоятельно расти на лактозе. Это значит, что им, в отличие от молочных сахаромицетов, не нужно поступаться принципами, отказываться от глюкозы и терпеть конкурентов.

Как мы помним, чтобы дрожжи могли усваивать лактозу, ее нужно расщепить и затащить моносахариды в клетку. Клюйверомицеты изменили порядок действий. Сначала они поглощают лактозу, для чего обзавелись лактозной пермеазой. А еще у них есть собственная лактаза, которая расщепляет поглощенный дисахарид на глюкозу и галактозу. После этого оба моносахарида готовы к употреблению. Клюйверомицеты неплохо растут на галактозе, но предпочитают все же глюкозу. Поскольку клюйверомицеты не нуждаются в помощи лактобацилл, у них нет необходимости делиться с ними глюкозой, и они выбирают более эффективный источник энергии. Глюкозные транспортеры у этих дрожжей сохранились, поэтому они хорошо растут на глюкозных средах. Глюкоза частично подавляет галактозный метаболизм, в одних штаммах сильнее, в других — слабее.

Известны три генетических варианта K. marxianus, но лишь у одного из них лактозная пермеаза настолько активна, что позволяет клеткам поглощать лактозу. Остальные живут на растениях. Помимо лактазы, они содержат другие ферменты, позволяющие им расщеплять многие полисахариды, в том числе полимер фруктозы инулин и пектин, образованный преимущественно остатками галактуроновой кислоты. Их находят на гниющих листьях, в глотке больных тонзиллитом, даже в экскрементах. Видовое название эти дрожжи получили в честь человека по фамилии Маркс, который в 1888 году выделил их с поверхности виноградин. При определенных условиях K. marxianus синтезируют этанол, их используют для производства спиртных напитков, в том числе традиционной мексиканской текилы.

Второй лактозоедный вид клюйверомицетов, K. lactis, существует в двух вариантах. У K. lactis var. drosophilarum генов лактазы и лактозной пермеазы нет, соответственно лактозу они не усваивают, а K. lactis var. lactis имеют оба лактозных гена, которые, судя по анализу геномной последовательности, получили от K. marxianus. Интрогрессия имела место не более 37 тысяч лет назад, но не позже 3700 лет назад. То есть она вполне могла произойти в то время, когда люди одомашнили молочный скот и вовсю ели сыр и другие продукты из переработанного микроорганизмами молока. По результатам исследования ископаемых зубов, молочные продукты занимали значительное место в человеческом рационе уже 5500 лет назад. Возможно, первые скотоводы поспособствовали отбору клюйверомицетов, растущих на молоке.

Клюйверомицеты не заменяют комбинацию «S. cerevisiae + лактобациллы», потому что молочнокислые бактерии образуют молочную кислоту, влияющую на консистенцию и вкус конечного продукта.

K. marxianus — ценный для пищевой промышленности вид, поскольку усваивает основные сахара, а именно лактозу и инулин, и очень быстро растет. Клетки удваиваются примерно раз в 70 минут, причем выдерживают нагрев до 52°С, что важно при некоторых производственных процессах. Эти дрожжи содержат витамины и ароматические соединения. Особо ценен 2-фенилэтанол, пахнущий розовыми лепестками. Некоторые штаммы используют для ароматизации продуктов и как пекарские дрожжи.

В конце прошлого века в Китае додумались до выпуска молочного пива. Делают напиток в два этапа. В первом участвуют молочнокислые бактерии, потом от них избавляются и добавляют дрожжи S. cerevisiae. Выпускают несколько сортов молочного пива, однако вкус у всех одинаковый. Производители надеются, что напиток станет приятнее и дешевле, если использовать для брожения K. marxianus. Сейчас китайские исследователи подобрали подходящий штамм, который позволяет получить очень приятное на вкус пиво, к тому же низкоалкогольное. Содержание спирта в нем составляет всего 0,48%, меньше, чем в хорошо выдержанном кефире (0,88%). В большинстве обычных видов пива содержится 3—5,5% этанола. Низкое содержание алкоголя в молочном пиве производители считают достоинством.

Возможно, истинное призвание K. lactis и K. marxianus состоит не в спиртовом брожении, а в получении безлактозных молочных продуктов. Лактозу не переносят две трети населения планеты и 98—100% жителей Юго-Восточной Азии, однако отказываться от молочных продуктов жалко: они содержат кальций, фосфор, холин, рибофлавин, витамины А и В₁₂. Неудивительно, что ассортимент безлактозных молочных продуктов постоянно увеличивается, их популярность стремительно растет, рынок активно развивается даже в тех странах, где большинство населения толерантны к лактозе. Значительную часть лактозы удаляют промыванием — она хорошо растворяется в воде. С расщеплением молочного сахара хорошо справляются молочнокислые бактерии, однако кисломолочные продукты не вполне свободны от лактозы. Тут и приходят на помощь клюйверомицеты.

Из дрожжей получают лактазу; фермент продают в капсулах, таблетках и каплях, которые дают возможность обработать молоко в домашних условиях или расщепить лактозу прямо в желудке. Молоко после ферментативной обработки теряет 70—100% лактозы и становится сладким, потому что в нем много освобожденной глюкозы. Следовательно, в безлактозные молочные продукты можно добавлять на 15—20 г/кг меньше сахара, и вкус при этом не изменится, а калорийность уменьшится. Здорово! А мороженое полезно обрабатывать лактазой безотносительно к переносимости молочного сахара. Если его концентрация будет высокой, велика вероятность, что лактоза при замораживании кристаллизуется, а это плохо. Мороженое, в котором на зубах похрустывают кристаллики, есть неприятно.

Исследования показывают, что безлактозное молоко вкуснее соевого, дети пьют его с бóльшим удовольствием, и кальций из него усваивается лучше.

Лактозу приходится расщеплять не только в молоке, но и в сточных водах. Обычно степень загрязнения оценивают по количеству кислорода, необходимого для ее окисления. Для окисления одного литра сыворотки нужно около 50 г кислорода (для окисления такого же количества бытовых сточных вод — всего 0,3 г). В загрязненных сывороткой водоемах мало кислорода, животные и растения там погибают. Отходов молочного производства просто море. Раньше не знали, куда их девать, а теперь на них растут клюйверомицеты и расщепляют лактозу — весьма кислородоемкий компонент сыворотки. Тут важно правильно подобрать условия. При хорошей аэрации эти дрожжи образуют биомассу, которую используют как корм для животных, сырье для получения ферментов и дрожжевого экстракта.

При определенных условиях клюйверомицеты синтезируют спирт, поэтому их пытаются использовать для производства биоэтанола все из той же молочной сыворотки. Для этого содержание лактозы в сыворотке повышают до 10—13 весовых процентов и проводят ферментацию при температуре 24—34°С. Лактозу можно расщепить почти полностью и добиться 75—85%-ного выхода этанола, то есть 538 г спирта на килограмм усвоенной лактозы. Концентрация алкоголя в сыворотке достигает 5—6%. К сожалению, такой сывороточный спирт пока обходится дорого, так что для получения биотоплива ферментация лактозы не подходит.

И сахаромицеты, и клюйверомицеты смогли расти на молоке после того, как получили набор необходимых генов в результате межвидовой гибридизации. Их пример вдохновляет исследователей, и они пытаются получить S. cerevisiae, которые могли бы расти на лактозе. Для пищевого производства дрожжей требуется много, и на чем-то их нужно выращивать. На традиционных питательных средах, таких как патока, пекарские дрожжи растут плохо, и запах от них не очень хороший. Патока представляет собой сложную смесь углеводов, и не все они годятся дрожжам в пищу. И пока S. cerevisiae не съедят всю глюкозу, остальные углеводы они трогать не станут. Это неэффективно, и пекарские дрожжи на такой среде растут хуже, чем могли бы. А когда дрожжам скармливают лактозу, глюкоза, образующаяся внутри клетки, быстро ассимилируется и никогда не достигает такой концентрации, которая полностью подавляет утилизацию галактозы. В конце 1990-х годов испанские ученые ввели S. cerevisiae комплекс лактозных генов K. lactis. Они получили штаммы, которые хорошо росли на молочной сыворотке и синтезировали этанол.

Дрожжи живут практически везде. Они в состоянии усвоить почти любой сахар и переработать его в спирт. А если сделать это сразу почему-то не удается, дрожжи найдут выход: откажутся от старых генов, добудут новые, но своего добьются.