Молекулы жизни и смерти
Конференция «Молекулярная диагностика-2018» состоялась 27—28 октября в «Президент-отеле» в Минске. Форум собрал 640 делегатов, с докладами выступили представители 15 стран. На конференции побывала Елена Клещенко.
Что это вообще такое — «молекулярная диагностика», зачем для нее придумали особый термин и модную аббревиатуру MDx? Разве обычный биохимический анализ крови работает не с молекулами? Да, в каком-то смысле так оно и есть: не с молекулами, а с химическими веществами. Биохимический анализ крови определяет присутствие в образце и концентрации веществ из некоего перечня, и предполагается, что все молекулы этого вещества имеют в целом одно и то же строение. Молекулярная диагностика имеет дело с такими молекулами, строение которых разнообразно и не всегда известно заранее: это ДНК, РНК, бактериальные белки, антитела человека. На нынешнем уровне — возможно, с единичными уникальными молекулами. А например, молекулярная эпидемиология изучает распространение инфекционной болезни не только по статистике заболеваемости в регионах, но и сравнивая геномы вирусных штаммов, выделенных от разных больных. При таком подходе в распоряжение врачей и ученых поступает огромное количество данных, поэтому особое значение (как и во всех областях современных наук о жизни) приобретает биоинформатика.
Антибиотики и «болезнь Х»
Современные люди боятся рака, инфарктов и инсультов, а вот инфекционных заболеваний — не очень. Они кажутся излечимыми и нестрашными, а что касается СПИДа, так им заражаются только аморальные люди из групп риска. На самом деле чем дальше, чем яснее, что эта идиллическая картинка далека от истины.
Сегодня в мире около 40 млн человек инфицированы ВИЧ, не менее 10 млн больны туберкулезом, а инфицированных, вероятно, гораздо больше — по данным ВОЗ, около четверти населения земного шара; более 300 млн заражены вирусными гепатитами. Гриппом и ОРВИ болеют 20—30% популяции каждый сезон; заболевания, конечно, несмертельные (если не считать младенцев и пожилых людей в тяжелом гриппе), но давайте прикинем, сколько лет жизни в сумме каждый из нас провел с больной головой, распухшим носом и пониженной до нуля трудоспособностью. А есть еще и другие, кроме СПИДа, заболевания, передающиеся половым путем, и в них нет ровно ничего смешного. Несмотря на усилия просветителей, люди все еще мало знают о папилломавирусах, в том числе о подтипах высокого риска, которые вызывают рак шейки матки, а также другие виды раков. А клещевые инфекции? Нет, это не только в тайге. Юлия Геллер (National Institute for Health Development, Таллин) подчеркнула, что исследование природных очагов в Прибалтике практически не финансируется, но на основании имеющихся данных можно предположить, что переносимые клещами патогены встречаются в Эстонии повсеместно. Клещевые инфекции — проблема и для Беларуси, 40% территории которой покрыта лесами. Как рассказала Людмила Карань (ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора), постоянный очаг клещевого энцефалита недавно выявлен на территории Москвы.
Кроме известных нам, существуют и неизвестные заболевания. Кто знает, сколько инфекционных агентов персистируют в популяциях животных, но могут передаваться человеку? Так произошло с тем же ВИЧ — вирус иммунодефицита обезьян, как теперь известно, передался человеку, скорее всего, при употреблении в пищу обезьяньего мяса. Вирусом Эбола человек также может заразиться от животных, и кто может сказать, сколько еще у природы подобных сюрпризов? Специалисты ВОЗ прогнозируют появление «болезни Х» —пандемии, которая убьет миллионы людей. Неизвестно, что это будет за болезнь, что за возбудитель ее вызовет. Исходя из всего, что мы знаем о людях и микроорганизмах, гарантировать можно одно: она придет. Сейчас много говорят, например, о вирусе обезьяньей оспы: выяснилось, что он передается не только от животных людям, но и от человека к человеку. Летальность оценивается «всего» в 10%, но кто поручится, что вирус не станет более патогенным в результате мутации?
 |
|
Выступает Анна Попова |
Это что касается естественных угроз. Однако не следует сбрасывать со счетов и угрозы антропогенные — биопреступления, биотерроризм, непреднамеренное создание опасных биообъектов. Биологическое оружие запрещено Женевской конвенцией 1925 года, но плохие парни могут играть и не по правилам, а доступность биотехнологий растет с каждым годом. Руководитель Роспотребнадзора, главный санитарный врач РФ Анна Попова, выступая на пленарном заседании в первый день конференции, упомянула гаражные биотехнологии как потенциальную угрозу национальной безопасности. Гаражный биотех назван так по аналогии с «гаражными изобретениями» — сейчас на самом деле необязательно работать в профильном институте, чтобы выделить ДНК и создать генно-модифицированную бактерию. Не то чтобы это было совсем просто, но теоретически уже возможно.
С другой стороны, можно не беспокоиться о сумасшедшем ученом, создающем у себя на кухне адскую чуму, когда к появлению супербактерий, вызывающих неизлечимые заболевания, приложил руку почти каждый из нас. Признавайся, читатель: назначал антибиотики сам себе? Прекращал самовольно курс антибиотиков, назначенный доктором? Поздравляем, ты враг человечества. Впрочем, и доктор не без греха, если выписал антибиотик «на всякий случай».
О проблеме лекарственной устойчивости микроорганизмов на конференции говорилось много. Проблема эта в последние пять лет обсуждается на самом высоком уровне. Одним из катализаторов послужило выступление в Давосе в 2014 году выдающегося британского экономиста Джима О’Нила. Самый впечатляющий его прогноз, который цитируют все, — если лекарственная устойчивость будет прогрессировать теми же темпами, что сейчас, то к 2050 году 10 млн человек ежегодно будет умирать от инфекционных заболеваний. Фактически мы вернемся в эру до открытия антибиотиков, к ситуации, знакомой нам из художественной литературы: туберкулез — приговор, воспаление легких — смертельно опасное заболевание, почти каждый взрослый человек в детстве видел смерть брата, сестры или товарища по играм. После такого о деньгах говорить неловко, и все же: сопутствующий ущерб мировому ВВП составит 8%, или более 210 триллионов долларов. Просто вообразите, что мы снова не умеем лечить туберкулез, только нас намного больше, чем в XIX веке, и живем мы теснее.
 |
|
Роман Козлов |
В 2016 году проблема антибиотикорезистентности обсуждалась на специальной сессии Генеральной ассамблеи ООН, а в сентябре 2017 года было опубликовано распоряжение правительства РФ по предупреждению и ограничению распространения антимикробной резистентности. Каждая страна должна будет принять меры и отчитаться в этом перед мировым сообществом. Как отметил член-корреспондент РАН Роман Козлов (Смоленский государственный медицинский университет МЗ РФ), «то, что обсуждали в профессиональной среде, стало предметом обсуждения на государственном уровне, а без государственной поддержки эту проблему решить невозможно».
Понятно, что для решения ее нужно прежде всего повысить грамотность врачей и пациентов. Каждый антибиотик — невосстановимый ресурс человечества, назначать их надо по делу, а назначив — принимать до конца, не оставляя бактериям, пережившим первые дозы (то есть тем, которые обладают некоторой устойчивостью) шанса на спасение. Роман Козлов отметил, что особая проблема для России — деятельность антивакцинального лобби: люди отказываются от положенных прививок, коллективный иммунитет падает, в результате даже относительно безвредные бактерии могут выйти из-под контроля.
Но мы не победим ни старые инфекции, ни новые, ни антибиотикорезистентные, если не будем развивать молекулярную диагностику. Постановка диагноза по симптомам — это упущенное драгоценное время: далеко зашедшее развитие болезни, случаи инфицирования, которых могло бы не быть, если бы человек раньше узнал диагноз. Ту же антибиотикорезистентность можно выявить старым добрым микробиологическим методом, выращивая клетки на агаре с добавлением интересующего антибиотика, но это займет дни. А можно отсеквенировать ДНК бактерии и сразу ответить на вопрос: есть ли у нее гены резистентности к конкретному антибиотику? И это позволит назначить лекарство осмысленно, а не «попейте пока тетрациклин, и посмотрим на динамику». На современном этапе обеспечение биологической безопасности невозможно без молекулярной диагностики.
Геномы людей и геномы клеток
Понятно, что инфекционные болезни были в центре внимания у организаторов конференции. Но есть и другие аспекты, о которых нельзя забывать, например наследственные заболевания. И опять же не следует думать, что это случается с кем угодно, только не с нами и нашими детьми. Член-корреспондент РАН Сергей Куцев (Медико-генетический научный центр РАН, Москва) привел такую статистику: 5% новорожденных имеют наследственные или врожденные заболевания, 80% из них проявляются в младшем возрасте и отвечают за 40% случаев ранней детской смертности. А диагностика до сих пор зачастую остается симптоматической.
Существуют системы неонатального скрининга. Например, в большинстве американских штатов обязательный скрининг новорожденных включает 34 заболевания, в штате Нью-Йорк около 50. Исследуют, как правило, не гены, а маркеры в крови методами масс-спектрометрии. В России новорожденных проверяют на пять заболеваний фенилкетонурию, врожденный гипотиреоз, галактоземию, муковисцидоз, адреногенитальный синдром. Это знакомый молодым мамам пяточный тест: из пятки младенца берут несколько капель крови, которые помещают на специальную бумагу. В некоторых регионах тестируют до 11 наследственных патологий, за деньги, в диагностических фирмах, можно проверить больше. За рубежом появляются и коммерческие тесты, ориентированные на гены.
Конечно, если скрининговый тест дал положительный результат, необходимо выполнить подтверждающий тест, чтобы узнать наверняка, прежде чем паниковать. Но даже когда результат положительный — в некоторых случаях это хорошая новость, если узнать ее рано: вовремя начатая терапия или простая коррекция диеты не позволят развиться патологии, ребенок вырастет практически здоровым. Сергей Куцев привел данные сравнительного исследования двух групп пациентов: у 178 человек наследственные заболевания были выявлены при скрининге, а у 142 — клинически. Тяжелые исходы у первой группы наблюдались всего в 2% случаев, а у второй — в 42%.
Есть и другой вариант — НИПТ, неинвазивное пренатальное тестирование. Новость последних лет — «жидкая биопсия», то есть определение ДНК плода в крови матери. Взятие крови намного менее травматично, чем настоящая биопсия, а мощность современных методов анализа ДНК позволяет выявлять таким образом, например, трисомии (лишние хромосомы).
Помимо однозначно патогенных мутаций есть и другие — отвечающие за мультигенные заболевания, то есть такие, которые связаны с состоянием множества генов. Подобных заболеваний намного больше, чем моногенных, вроде гемофилии, и их изучение, по сути, только начинается. Как сказал член-корреспондент РАН Дмитрий Сычев (Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования МЗ РФ, Москва), подход «ген-кандидат» уходит в историю. Его сменяет полногеномный ассоциативный анализ, он же полногеномный поиск ассоциаций, или GWAS — масштабное исследование, в котором сопоставляются некий фенотип, например болезнь или ее отсутствие, и генетические особенности. Если у здоровых людей в определенном месте определенного гена чаще стоит нуклеотид Т, а у больных G, можно предположить, что именно это отличие связано с болезнью, и таких значимых отличий иногда находят сотни для одной болезни. Это уже епархия персонализированной медицины, как и исследование генов, отвечающих за метаболизм лекарственных препаратов. Клиническая фармакология ближайшего будущего будет назначать больному лекарства, сообразуясь с его генетической картой.
Важнейшая область медицинской генетики — онкогенетика. Сейчас никто не спорит с тем, что нет единого заболевания под названием «рак», это слово объединяет множество болезней, которые надо по-разному лечить. И в основе их разнообразия лежат генетические изменения. Современная классификация онкологических заболеваний — уже не морфологическая, а молекулярная, она использует полимеразную цепную реакцию (ПЦР) или высокопроизводительное секвенирование. «Морфолог, который не имеет связей с генетической лабораторией, не имеет права ставить диагноз», — сказала Анна Портянко (Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н.Александрова, Минск).
Член-корреспондент НАНБ Ольга Алейникова (Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии Минздрава Республики Беларусь, Минск) сделала сообщение о молекулярной диагностике в детской онкологии — эта область прекрасна тем, что из нее чаще приходят хорошие новости, некоторые ранние раки переходят в категорию излечимых. Практически нет ни одной лейкемии, где в патогенезе не лежала бы та или иная молекулярная поломка, но не все они одинаково опасны: при одних удается вылечить четверых из пяти детей, при других — лишь каждого третьего. Молекулярная диагностика позволяет дать прогноз и выбрать оптимальное лечение.
NGS и MALDI-TOF
Конечно, на конференции не обошлось без разговора о методах, которые делают возможными все эти замечательные исследования, позволяют ставить такие вопросы, как «насколько разнообразны вирусы внутри одного пациента», «как эволюционирует геном опухоли» и «давайте быстро узнаем, убьет ли эту бактерию рифампицин». Секция, посвященная NGS — next generation sequencing, оно же высокопроизводительное или массовое параллельное секвенирование — началась в 8:30 утра, и зал был полон.
Напомним, почему next generation. Секвенированием первого поколения сейчас называют секвенирование по Сэнгеру (см. «Химию и жизнь, 2018, 8) — классический метод, который когда-то лег в основу первых приборов для автоматического секвенирования, да и по сей день считается наиболее надежным. «Секвенирование следующего поколения», оно же «высокопроизводительное», — собирательное название множества методов, которые появились после 2000 года и не используют сэнгеровскую технологию. Они основаны на разнообразных принципах, общее у них то, что читается одновременно множество нитей ДНК, зато довольно коротких — как правило, сотни нуклеотидов, а затем программное обеспечение состыковывает прочтенные кусочки текста в единую последовательность.
К NGS относится, например, секвенирование Solexa (Illumina), то есть технология, разработанная в компании Solexa, позднее приобретенной компанией Illumina. Суть ее в том, что, когда к цепочке ДНК присоединяется очередной нуклеотид, комплементарный исследуемой цепочке, прибор регистрирует вспышку — каждый из четырех нуклеотидов несет флуоресцентную метку своего цвета. «Иллюмина» сегодня — один из лидеров рынка. Компания Thermo Fisher Scientific предлагает клиентам ионное полупроводниковое секвенирование — оно основано на регистрации протона Н+, который высвобождается, когда к цепочке присоединяется очередной нуклеотид.
 |
|
Луиза Ладбрук. Справа MinION — карманный секвенатор компании Oxford Nanopore |
А вот то, что предлагает своим клиентам британская компания Oxford Nanopore Technologies, — это уже секвенирование третьего поколения. Нанопоровое секвенирование — очень элегантный метод: молекула ДНК или РНК протаскивается через пору в мембране, помещенной в специальную камеру с раствором; по разные стороны от мембраны есть разность потенциалов. В зависимости от того, какое азотистое основание проходит сквозь пору, сила тока падает и снова растет. Эти колебания регистрируются, и по ним восстанавливается нуклеотидная последовательность! Недостаток метода — его относительно низкая точность, а преимущества — возможность работать с буквально единичными молекулами и фантастически длинные прочтения (риды), то есть последовательности, которые можно считать с одного фрагмента ДНК. Как напомнила в своем докладе Луиза Ладбрук (отдел продаж Oxford Nanopore Technologies, Великобритания), в этом году была достигнута рекордная длина рида — более 2 200 000 нуклеотидов. Два с лишним миллиона! Новый прибор Oxford Nanopore, PromethION, может прочитать 7 терабаз за 48 часов. Еще один важный плюс нанопоровских секвенаторов — их компактность: многие из них выглядят, как карманные устройства, подключаемые через USB-порт к ноутбуку или смартфону. Идея в том, чтобы секвенировать всегда и везде, определять геномы вирусов, растений и животных в полевых условиях, быстро и относительно недорого. Однако эти секвенаторы приобретают и стационарные лаборатории для решения серьезных экспериментальных задач.
 |
|
Олег Гусев и Герман Шипулин |
Олег Гусев (RIKEN — Казанский федеральный университет), много лет работающий в Японии, рассказал о консорциуме MUSCLE-FANTOM — совместном проекте института японского института RIKEN и КФУ. Это первый консорциум по геномике, которым руководят русские исследователи. Он возник как продолжение знаменитого проекта FANTOM, который занимается некодирующей частью генома млекопитающих, — тем, что раньше легкомысленно называли мусорной ДНК. Как выяснилось, этот «мусор» регулирует активность генов, поэтому «осмысленная» часть, кодирующая белки, без него ничто. MUSCLE-FANTOM исследует механизмы формирования и ремоделинга мышц человека, активность промоторов и энхансеров транскрипции РНК в мышечной ткани в норме и при патологии. Оказывается, множество мутаций, связанных с болезнями, находится вовсе не в кодирующих областях, которые обычно секвенируют, а в тех же энхансерах. А для этих исследований необходимы современные технологии NGS. Я спросила Олега Гусева, почему они выбрали нанопоровое секвенирование, как-никак метод новый, непривычный. Оказалось, именно из-за длинных ридов: для задач проекта бывает важно прочесть целиком полноразмерную РНК: «Иллюминовские короткие прочтения этого не могут дать. Здесь приходит на помощь Oxford Nanopore».
Многие доклады на этой секции были посвящены нетривиальным применениям высокопроизводительного секвенирования, не всегда именно медицинским. Камиль Хафизов (ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва) рассказал о проекте, совместном со Сколтехом, по анализу продуктов питания растительного происхождения, например чая. «То, что вы завариваете, — далеко не всегда то, что написано на коробочке. А попутно там еще много плесневых грибов обычно, так что вы завариваете грибы», — пояснил Хафизов. Об анализе пчелиного меда с помощью NGS подробнее рассказала Анна Сперанская (ЦНИИЭ, МГУ им. М.В.Ломоносова; Сколковский институт науки и технологий, Москва). Когда продавец называет свой мед «липовым» или «гречишным», он не обязательно врет — возможно, он честно вспоминает, какие растения цвели во время сбора, но вряд ли знает точно, к этим ли растениям летали его пчелы, или, может быть, к каким-то другим. Это можно проверить с помощью анализа пыльцы под микроскопом, но данный метод не всегда позволяет определить растение до вида и требует высокой квалификации. А вот секвенирование определенных участков ДНК растений (баркодов) дает более точный ответ. В конце доклада Анна добавила, что коллеги всегда с интересом следят за их работой, спрашивают, не закончен ли уже ДНК-анализ вот этой баночки и нельзя ли перейти к органолептическому исследованию содержимого…
Павел Скумс (факультет информатики Университета штата Джорджия) рассказал о молекулярно-биоинформатических детективах — о том, как на современном этапе расследуются вспышки вирусных заболеваний. В этих историях не всегда виноваты природа и чье-то невезение. Бывает, что озлобленный человек, зная, что у него вирус, нарочно игнорирует меры безопасности, бывает и похуже — наркозависимый медработник ворует обезболивающие у пациентов, не меняет шприц и заражает множество людей вирусным гепатитом. Кроме того, и при расследовании самых обычных эпидемий важно бывает установить ее начало. В этой области технологии NGS совершили прорыв — там, где раньше удавалось получить один вирусный геном, теперь получают несколько десятков, а сравнение мутаций в этих геномах (конечно, не на глазок, а с помощью методов биоинформатики) позволяет установить, кто из них от кого произошел и, соответственно, кто кому передал вирус. В этом исследовании можно учитывать не только информацию о геномах, но и то, что происходит в макромире, например, эпидемиологические данные или математические свойства социальных связей, объединяющих людей (последнее умеет делать алгоритм QUENTIN, разработанный докладчиком с коллегами).
Кроме высокопроизводительного секвенирования, есть ДНК-микрочипы. Принцип метода следующий: к чипу пришиваются ДНК-зонды, комплементарные определенным последовательностям. Если с конкретным зондом гибридизуется ДНК образца, в данной точке при лазерном сканировании чипа появляется флуоресцентное свечение — это значит, что данная последовательность есть в анализируемой ДНК. Во многих случаях практичнее использовать их, а не NGS. Для анализа белков широко применяются иммуночипы с антителами к специфическим белкам — например, к тем, что характерны для патогенных бактерий.
Секвенирование нуклеиновых кислот — наше всё, но в последнее время много говорят о новом аналитическом методе: MALDI-TOF. Метод MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) основан на получении масс-спектра компонентов под действием коротких высокоинтенсивных импульсов лазера. Для идентификации биомолекул он применяется в сочетании с технологией TOF (time of flight) — разделения ионов в вакууме на основе разного времени их пролета. С помощью MALDI-TOF уже определяют и видовую принадлежность патогенов, и антибиотикорезистентность бактерий, и даже то, не выпивал ли пациент в последние недели (ничего смешного: при патологиях печени бывает жизненно важно убедиться, что больной не лжет врачу на этот счет).
 |
|
Герман Шипулин |
О ситуации с молекулярной диагностикой в России рассказал на пленарном заседании Герман Шипулин (ЦНИИЭ Роспотребнадзора), ответственный секретарь оргкомитета и один из самых главных организаторов конференции. В РФ сейчас свыше 5000 лабораторий молекулярной диагностики. Установлено около 500 приборов для секвенирования по Сэнгеру и около 200 — для NGS. (Это мало: Олег Гусев иронично заметил, что в Китае отсеквенировано больше геномов собак, чем у нас — людей. Но радует положительная динамика.) Вопрос с реагентами практически решен благодаря производству в ЦНИИЭ, компаниям «ДНК-технология», «Вектор-Бест». Понятно, что наши реагенты адаптированы к приборам иностранных фирм. Тем не менее первый отечественный капиллярный секвенатор «Нанофор-05» от компании «Синтол» уже неплохо себя показал. Технологиями одномолекулярного секвенирования занимается российская компания «ГАММА-ДНК» в Сколково, создание NGS-секвенатора планирует и «Синтол».
Вместо заключения
Помните «Колыбель для кошки» Курта Воннегута, Четырнадцатый том сочинений Боконона? «Может ли разумный человек, учитывая опыт прошедших веков, питать хоть малейшую надежду на светлое будущее человечества?» — «Прочесть Четырнадцатый том недолго. Он состоит всего из одного слова и точки: “Нет”». Трудно не процитировать классика, когда думаешь обо всем этом. О «болезни Х», о растущей численности городского населения и бедности стран третьего мира. О человеческой глупости, которая мешает соблюдать элементарные меры безопасности, побуждает покупать в аптеке антибиотик «просто так» и прекращать его пить на третий день. О той разновидности глупости, которая радуется эпидемии в чужой стране и не понимает, что это аплодисменты пожару в соседской квартире, — патогены не знают, что такое государственные границы. Об откровенно суицидальной активности антипрививочников и ВИЧ-отрицателей. О медленной реакции руководящих органов всех стран. Но потом посмотришь в зал во время доклада — врачи, ученые, производители приборов и реагентов, люди, принимающие решения на всех уровнях; Россия, Беларусь, Украина, Прибалтика, Казахстан, США, Великобритания, Китай, Япония… Столько людей, которые понимают, что происходит, и знают, что делать. Все же есть небольшая надежда, что человечество сдаст экзамен на выживание.
Эта статья доступна в печатном номере "Химии и жизни" (№ 10/2018) на с. 2 — 6.