Кэри Муллис, великий и ужасный

Художник П.Перевезенцев

Эта история пересказывалась в бесчисленных статьях (в том числе и в журнале «Химия и жизнь», 2006, 8), нескольких книгах и одной Нобелевской лекции. Но сейчас появился повод рассказать ее еще раз. Седьмого августа ушел из жизни Кэри Муллис (1944–2019).

Майским вечером 1983 года по горной дороге в Калифорнии ехала машина, за рулем которой был малоизвестный 38-летний биохимик — сотрудник фирмы ≪Cetus≫, любитель женщин и серфинга. Он обдумывал небольшую проблему, связанную с выявлением мутаций в ДНК, а на соседнем сидении дремала его подруга. Внезапно он остановил машину и быстро стал что-то записывать. Сломал карандаш, продолжал писать ручкой. Подруга удивилась, попросила ехать дальше, но через милю он остановился снова. Идея, которая пришла ему в голову, была одновременно сногсшибательной и слишком простой: наверное, в ней есть ошибка либо кто-то уже обнаружил это раньше. Но если нет ошибки и все придумано впервые, то впору кричать: «Эврика!».

Нобелевская лекция, в которой автор открытия рассказал об этой поездке, была произнесена им десять лет спустя. Автора звали Кэри Муллис. А метод, придуманный им, получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР), и вся молекулярная биология разделилась на периоды «до ПЦР» и «после».

Ранние годы

Как положено, интерес к химии у Муллиса возник в детстве. Интереснее всего, конечно, было что-нибудь взрывать вместе с товарищами, или поджигать термитную смесь, или запускать в небо ракету с лягушкой так, чтоб пассажирка вернулась живой на землю (эпоха после запуска первого спутника, мечты о космосе, сами понимаете). Все необходимое, от реактивов до бикфордова шнура, тогда можно было легко купить.

В студенческие годы Муллис работал в компании ≪Columbia Organic≫ — сначала занимался закупками реактивов, потом ему с приятелем Элом доверили синтезировать недостающие вещества. Лабораторию устроили в гараже, и без приключений не обошлось: так, после синтеза бромацетофенона в гараж случайно зашла бабушка Эла. А бромацетофенон имеет слезоточивый эффект, и бабушка потом некоторое время не разговаривала с внуком. Но сильно она не пострадала, а вот кусту камелий, который рос рядом с импровизированной вытяжкой, повезло меньше. Другая история случилась уже рядом с химической лабораторией Технологического института Джорджии, где Кэри Муллис усердно учился: ему потребовалось избавиться от ненужных запасов алюмогидрида лития, и полицейского, стоявшего поодаль, до глубины души поразил столб алого пламени над сточной канавой.

Потом была учеба в Беркли, где научным руководителем Муллиса стал Джо Нейландс. Он давал своим аспирантам свободу: работайте над тем, что вам интересно, только все-таки по возможности учитесь и постарайтесь защититься. Нейландс тогда не слишком надеялся на большие научные успехи юного Муллиса: тот слишком разбрасывался, слишком интересовался женщинами, да к тому же в конце 60-х годов активно (и не всегда удачно) экспериментировал с пока еще не запрещенными наркотиками — и как химик-синтетик, и как потребитель. Однако время на науку все же находилось. А в 1968 году Муллис накатал статью «Космологическая значимость обращения времени» и послал ее в самый престижный научный журнал — «Nature». Вообще-то космологией он не занимался: все его знания были почерпнуты из книжек и, по его собственному признанию, из опыта употребления психоактивных препаратов. Но времена были свободные, и статью нахального аспиранта напечатали.

После Беркли начался период поиска себя. Детская кардиология, фармацевтическая химия, неудачная попытка стать писателем, бурная семейная и личная жизнь —и в конце концов возвращение в химию. Калифорнийская компания «Cetus» была одним из первых биотехнологических предприятий. В 1979 году до тамошних знаменитых работ по интерлейкину и интерферону было еще далеко. Зато там давали деньги под синтез ДНК. Олигонуклеотиды (короткие цепочки ДНК) производились легко и в больших количествах, и у Муллиса возник вопрос: но что-то же надо с ними делать? Может быть, удастся их как-то применить в диагностике?

В 1983 году Муллис в своей работе столкнулся с небольшой проблемой, которая касалась обнаружения точечных мутаций в ДНК — в том числе тех, которые приводят к тяжелым генетическим заболеваниям, таким как серповидноклеточная анемия. Об этой проблеме он и думал за рулем в тот самый вечер. И собственно, именно в процессе размышлений о технических трудностях возможных экспериментов и способах их преодоления (для интересующихся — все подробности рассказаны в его Нобелевской лекции, английский текст которой легко найти в Интернете) он внезапно понял: та процедура, которая почти случайно пришла ему в голову для решения конкретной задачи, является универсально значимой. Потому что это способ быстро и легко получить любое количество копий интересующего нас участка ДНК.

Открытие

Действительно, с самых ранних времен молекулярной биологии именно размножение нужного участка ДНК было одной из центральных проблем. Хромосомная ДНК имеет огромную протяженность, а количество ее копий в биообразце обычно мало, порой в нашем распоряжении есть только единичная молекула. А для мало-мальски удобных исследований нужно, чтобы все было наоборот: много копий сравнительно небольшого участка, с которым мы хотим работать. (До ПЦР эти копии получали методом клонирования ДНК с помощью бактерий, в некоторых случаях его применяют и сейчас, но он намного дольше, неудобнее и дороже.)

Идея ПЦР невероятно проста, и ее понимание не требует никаких дополнительных знаний — достаточно описания и картинки. Напомним: ДНК состоит из звеньев-нуклеотидов четырех типов: А, G, C и Т (от названий входящих в них азотистых оснований: аденин, гуанин, цитозин и тимин). В молекуле ДНК две нити, каждая из которых полностью определяет другую: напротив G в одной нити всегда стоит C в другой, а напротив A всегда стоит Т. Это соотношение называется комплементарностью. Именно благодаря ей молекула ДНК копирует себя при делении клетки: нити разделяются, на каждой строится комплементарная нить из нуклеотидов, а основной фермент, который за это отвечает, называется ДНК-полимераза. В результате из одной молекулы получаются две точно такие же.

Структура ДНК

Небольшое дополнительное замечание. Два конца каждой нити ДНК химически не эквивалентны между собой. Один называют 5’-концом, другой 3’. Присоединение новых нуклеотидов возможно только с 3’-конца, то есть у каждой нити есть определенное направление. И в двойной спирали ДНК две комплементарные нити всегда направлены противоположно.

Итак, что же можно сделать, чтобы получить любое число копий интересующего нас участка ДНК (назовем его мишенью)? Прежде всего надо синтезировать две коротких одноцепочечных ДНК, которые называются праймерами. Они комплементарны двум участкам ДНК на концах фрагмента-мишени: для молекулы на рисунке — левому участку верхней нити и правому участку нижней нити. Праймеры в большом количестве добавляют к раствору исходной ДНК. Туда же добавляют смесь четырех нуклеотидов, из которых и будут строиться копии интересующего нас участка.

А дальше действуем согласно рисунку.

Принцип ПЦР

а) Денатурация. В начале каждого цикла нагреваем двуспиральную ДНК, и она разделяется на две нити.

б) Отжиг. Охлаждаем. Праймеры связываются с концами фрагмента-мишени.

в) Удлинение. Добавляем ДНК-полимеразу, ждем. Праймеры удлиняются.

Переходим к следующему циклу.

Из рисунка видно, что уже с третьего цикла получаются двуспиральные копии только нужного участка ДНК (обведены рамками). Конечно, образуется много мусора — копий «с хвостами». Но их число растет линейно — а число копий нужного участка растет экспоненциально! После третьего цикла их немного, но уже после десятого цикла их тысяча. А после тридцатого — миллиард. И если удастся автоматизировать процесс…

Все стадии, изображенные на рисунке, были хорошо известны. Но до Муллиса никому не приходило в голову их объединить.

Правда на самом деле все-таки приходило. Постфактум удалось раскопать статью 1971 года в «Journal of Molecular Biology» (которую Муллис вряд ли видел). Одним из ее авторов, кстати, был великий Хар Гобинд Корана — участник расшифровки генетического кода и нобелевский лауреат. В этой работе высказана сходная идея о копировании небольшой синтетической молекулы ДНК. Но эксперимент то ли был проведен, то ли нет, о результатах ничего не сказано. И не было главного: понимания, зачем это нужно. Недаром до открытия Муллиса (и последующих патентных споров) статью 1971 года выпустили из вида. В конце концов, викинги побывали в Америке за полтысячи лет до Колумба, но кого это сейчас волнует, кроме историков?

Победа

Обдумав новую идею на выходных, потрясенный Муллис в понедельник на работе попытался расспросить коллег: может быть, такие циклические реакции на самом деле давно используются, а он просто не в курсе? Нет, никто ничего такого не использовал. Но никто и не был взволнован: мало ли какие безумные идеи бывают у людей...

В сентябре 1983 года Муллис впервые попытался реализовать свою идею в лаборатории. Наскоком ничего не вышло: условия были подобраны неверно. А вот в декабре пришел первый успех: удалось размножить небольшой фрагмент плазмиды, маленькой кольцевой молекулы ДНК. Правда, Муллис в это время сильно переживал из-за любовной неудачи и не особенно обрадовался.

В 1985 году первая статья с описанием работы, проведенной с использованием ПЦР, появилась в ≪Science≫. При этом само описание метода Муллису не удавалось опубликовать в ведущих журналах — в редакции «Nature» его сочли малоинтересным (то ли дело космологические фантазии!), да и в «Science» отреагировали лишь спустя несколько лет. Зато бурно.

Кстати, анекдотическая подробность: авторам статьи 1985 года в «Science» предъявило претензии американское правительство. Почему публикация не была согласована с Министерством энергетики? Название «цепная реакция» вызвало у кого-то ассоциации с ядерными процессами, и пришлось объяснять разницу между ДНК и атомной бомбой.

А к 1986 году подоспело важное усовершенствование. Дело в том, что автоматизации процесса мешала одна неприятная проблема: ДНК-полимераза, использовавшаяся на первых порах, теряла свою активность при нагревании, как и вообще большинство белков. Поэтому в каждом цикле ее требовалось добавлять заново. Рэндалл Сейки и Генри Эрлих из «Cetus» стали использовать Taq-полимеразу — аналогичный фермент из бактерий Thermus aquaticus, живущих в горячих источниках. Она не портилась даже при нагревании до 70–75°С, и ее достаточно было добавить к реакционной смеси всего один раз — в самом начале.

Тут потихоньку стали появляться общедоступные автоматические приборы, первым из которых стал PCR-1000 Thermal Cycler. Примерно тогда же пришло и признание в научном сообществе, которое стало расти примерно так же, как количество копий участка-мишени при ПЦР, — лавинообразно. С компанией ≪Cetus≫ Муллис вскоре расстался (связанные с этим вопросы денег и патентных прав — отдельная непростая история), а метод ПЦР продолжил свое победное шествие и продолжает его по сей день.

Сейчас ПЦР используют при диагностике генетических и онкологических заболеваний, обнаружении и мониторинге вирусных инфекций, анализе генетического материала в криминалистике, установлении родства, при генно-инженерных и исследовательских манипуляциях. Во многих тысячах лабораторий стоят маленькие аккуратные приборчики для проведения ПЦР — амплификаторы. Есть ПЦР с обратной транскрипцией (для анализа РНК), ПЦР в реальном времени, позволяющая определить не только присутствие фрагмента-мишени, но и его изначальную концентрацию, инвертированная ПЦР и еще с десяток разновидностей метода. И даже те из нас, кто никогда не слышал про полимеразную цепную реакцию, живут в мире, который изменился благодаря ей.

Нобелевская премия казалась неизбежной: вопрос был только в том, когда именно. Джо Нейландс, друг и бывший руководитель Муллиса, на всякий случай советовал ему вести себя скромнее: ладно женщины и серфинг, но если везде рассказывать и о прошлом опыте с ЛСД, то Нобелевский комитет может решить подождать лет двадцать, пока беспокойный клиент не угомонится. Но в результате все произошло довольно скоро — через десять лет после фактического открытия ПЦР, через считанные годы после ее широкого распространения.

В том же 1993 году премию по химии получил канадец Майкл Смит — за другие исследования ДНК (сайт-специфический мутагенез). На Нобелевскую церемонию оба биохимика приехали с бывшими женами, с детьми и с новыми подругами. Именно тогда Кэри Муллис прочел свою знаменитую Нобелевскую лекцию, познакомился с семейством Клинтонов и шведской королевской семьей — заодно предложил своего сына в жены принцессе, попросив в приданое всего лишь треть королевства. Во фраке, сшитом для нобелевской церемонии, Кэри через несколько лет женился в четвертый раз, и этот брак, в отличие от предыдущих, оказался прочным и счастливым.

Танцы на поле разума

Конечно, у Муллиса были и другие изобретения (включая пластик, меняющий цвет при ультрафиолетовом облучении), а в последние годы — основанная им компания «Altermune», где изучали способы модификации иммунного ответа. Но, как часто бывает, все последующие результаты были несопоставимы с его главным достижением.

Знаменитый астрофизик Мартин Рис однажды сказал: «Я замечаю три разных способа стареть среди ученых. Первые два — стать администратором или удовлетвориться посредственной научной работой. Третья возможность — без подготовки броситься на неведомую территорию и быстро столкнуться с чем-то непосильным».

Человек с темпераментом Кэри Муллиса должен был выбрать третий путь. Конечно, не он первый и не он последний. Лайнус Полинг, величайший химик XX века, прославлял чудодейственные свойства витамина С и создавал ≪ортомолекулярную медицину≫. Брайан Джозефсон, до сих пор здравствующий нобелиат 1973 года по физике, известен своим интересом к парапсихологии и гомеопатии. Но Муллис проявил исключительную разносторонность: трудно найти популярную область, где бы он не отметился необычными и громкими заявлениями. И не всегда можно понять, были эти заявления высказаны всерьез или ради тонкого издевательства.

Так, Муллис разругал психологов и социологов за то, что они не учитывают такую важную вещь, как астрология, — «ведь не случайно три незнакомца верно угадали, что я Козерог». Но астрологией сейчас мало кого удивишь, а вот и кое-что более необычное: про Муллиса говорили, что это единственный нобелевский лауреат, общавшийся с инопланетянами. В 1985 году, идя с фонариком в уборную на своем участке в Калифорнии, он —как сам рассказывал —встретил светящегося енота, который сказал: ≪Добрый вечер, доктор≫. Утром, после некоторого провала в памяти, Муллис обнаружил, что рядом нет ни енота, ни фонарика. Он уверял, что в тот момент был в трезвом уме и что наверняка судить об инопланетной природе встречи не может, но есть, есть указания на то, что в этом месте произошло нечто странное.

Впрочем, главное в другом. Кэри Муллис не выносил Систему. Он был убежден: политики, чиновники, группы влияния вытесняют настоящий научный метод, играя на наших чувствах вины и страха, подчиняя направления исследований своим интересам, подменяя серьезные доказательства пропагандой. И чем более модной и общепринятой была теория, тем с бoльшим удовольствием он ее отвергал.

Его раздражали концепции здорового питания: ладно, я и сам не люблю маргарин, но если вы говорите о его злодейской сущности, то где убедительные доказательства? Он критиковал популярные представления о влиянии человека на озоновый слой и на климат. В своей критике он ссылался на принципы Роберта Бойля и Лондонского королевского общества: если вы не можете что-то измерить или сделать точные предсказания на основе своей теории и представить их коллегам, не беспокойте нас этим!

И что поразительно, Кэри Муллис не верил в однозначную связь между ВИЧ и СПИДом. Он поддерживал печально знаменитых ВИЧ-диссидентов, не раз говорил о своих взглядах на лекциях — а лектором он был популярным. Бывало, что его лекции отменяли, узнав, что он собирается говорить не о ПЦР, а о СПИДе, и однажды за такую отмененную лекцию он вдруг получил приличную денежную компенсацию от фирмы «Glaxo» — производителя азидотимидина, лекарства против ВИЧ. Муллис злорадно отмечал: «Никогда я не получал таких сумм за то, что просто ничего не делал».

Казалось бы, в вопросе о связи ВИЧ и СПИДа не надо приводить доказательства. Но Муллис никогда не был вирусологом, и к тому же его взгляды на проблему сформировались еще в 80-е годы XX века. Тогда информации было намного меньше, чем сейчас, а затем, наверное, от заявленной позиции уже было невозможно отказаться. Ирония в том, что и тогда, и сейчас именно ПЦР чрезвычайно полезна при диагностике ВИЧ-инфекции — как способ прямого выявления вируса вместо обнаружения антител к нему. Это дает, например, возможность ранней диагностики инфекции, диагностики у новорожденных (при необходимости), а также объективного контроля эффективности терапии. Словом, в ряде случаев именно ПЦР — метод выбора. И она же — метод, позволяющий разбить многие аргументы ВИЧ-отрицателей.

В 1998 году вышла полуюмористическая автобиография Муллиса «Танцуя нагишом на поле разума». (К сожалению, перевод не передает игру слов — оригинальное название «Dancing Naked in the Mind Field» отсылает к известному музыкальному альбому «Dancing Naked in the Minefield», где голые танцы исполняются на минном поле.) Некоторые фразы из этой книги стоит процитировать просто ради удовольствия.

«Химики всегда считают себя умнее биохимиков. Конечно, физики считают себя умнее химиков, математики считают себя умнее физиков, а философы одно время считали себя умнее математиков, пока в этом столетии они не обнаружили, что им уже толком не о чем говорить».

«Человек, написавший инструкции по безопасному использованию хлорида натрия в лаборатории, видимо, считал, что это смесь металлического натрия и газообразного хлора, а не то невинное соединение, которое люди добавляют в еду для улучшения вкуса и называют солью. Вот что происходит, когда у правительственных органов, где никто ни перед кем конкретно не отвечает, срывает крышу».

«У людей, включая математиков, есть такое представление: чем меньший размер имеет что-то, тем больше его фундаментальная важность. В то же время чем больший размер имеет что-то, тем больше его фундаментальная важность. Может быть, имеет смысл пересмотреть наши взгляды на фундаментальное?»

Скептически относясь к успехам противораковой химиотерапии, Муллис писал: «Мне не нужны лекарства, из-за которых мои волосы выпадут». Ему не пришлось думать о том, принимать или не принимать эти лекарства. В августе 2019 года он умер от воспаления легких.

Ему было 74 года.

Эта статья — дань его памяти.

Эта статья доступна в печатном номере "Химии и жизни" (№ 9/2019) на с. 2 — 5.