Электронный микроскоп, точный расчет и холодный образец

Курамшин А.И.
(«ХиЖ», 2017, №11)

Лауреатами Нобелевской премии по химии за 2017 год стали Жак Дюбоше (Университет Лозанны, Швейцария), Йоахим Франк (Колумбийский университет, Нью-Йорк, США) и Ричард Хендерсон (Кембридж, Великобритания). Награду они получили за «разработку методов криоэлектронной микроскопии высокого разрешения, позволяющих определить структуру биомолекул в растворе». Пресс-релиз Нобелевского комитета поясняет, что метод криоэлектронной микроскопии открыл новую эру в биохимии и помог заполнить множество пробелов в наших знаниях о молекулах жизни.

Некоторые интернет-ресурсы в день объявления лауреатов отреагировали на новость броскими заголовками, например: «Нобелевскую премию по химии дали за мгновенную заморозку биологических образцов». Так что же самое важное в криоэлектронной микроскопии: процесс заморозки, адаптация электронной микроскопии к нуждам биохимии, сочетание методов или что-то другое?


Начало большого пути

В 1968 году была опубликована заключительная часть научно-популярной трилогии Георгия Гамова «Мистер Томпкинс в стране чудес». Она была написана в соавторстве с микробиологом Мартынасом Ичасом и называлась «Мистер Томпкинс внутри самого себя. Приключения в новой биологии». В книге рассказывалось о том, как мистер Томпкинс в сопровождении семейного врача изучает клеточное строение своего тела и плавает по своим кровеносным сосудам. Рассказывая о деталях строения клеток, экскурсовод пояснял Томпкинсу, что вся эта информация получена с помощью электронного микроскопа. Читателям становилось очевидным, что электронная микроскопия уже позволяет изучать биологические ткани и отдельные клетки, получать изображения биологических объектов с невиданной четкостью и деталировкой. На самом деле еще лет десять назад ученым оставалось только мечтать об использовании электронного микроскопа для изучения атомно-молекулярной архитектуры биологически активных молекул (ведь они все-таки существенно меньше клеток).

pic_2017_11_06.jpg

1. На примере молекулы фермента глутаматдегидрогеназы показано, как улучшалось разрешение методов криоэлектронной микроскопии. Сегодня она дает возможность изучать биологические объекты в атомном разрешении (ленточная структура белка на крайнем правом фрагменте рисунка). 

Мечта сбылась совсем недавно, спустя четыре десятка лет после углубления мистера Томпкинса в самого себя, и это в значительной мере заслуга Жака Дюбоше, Йоахима Франка и Ричарда Хендерсона. Благодаря их открытиям мы можем исследовать все детали структуры биомолекул непосредственно в растворе (рис. 1).

Путь электронной микроскопии в биохимию не был усыпан розами. Вскоре после того, как в 1931 году Эрнст Август Фридрих Руска продемонстрировал принцип работы электронного микроскопа — это принесло ему Нобелевскую премию по физике 1986 года, — венгерский физик Ладислав Мартон написал статью, в которой утверждал, что шансы применения ЭМ-микроскопии для изучения биоматериалов равны нулю, поскольку «интенсивная бомбардировка живых клеток электронами приведет к их разрушению» («Nature», 1934, 133, 911—911, doi: 10.1038/133911b0).

Не исключено, что именно благодаря Мартону перед Дюбоше, Франком и Хендерсоном встала сложная, но, согласитесь, приятная задача — подготовка нобелевских лекций. В том самом письме 1934 года в редакцию «Nature» Мартон предложил возможные методы адаптации электронной микроскопии для исследования биологических объектов — заморозка либо метод, напоминающий негативное контрастирование. Разумеется, в то время подобные подходы были чистым теоретизированием.

Решения еще одной проблемы Мартон не увидел: в рабочей камере электронного микроскопа из биологического образца испаряется вода и вследствие этого изменяется структура белков и нуклеиновых кислот. Очевидны были и другие проблемы: биологические объекты могли иметь крайне низкую контрастность при прохождении через них электронов с высокой энергией; энергию электронного пучка нельзя было делать очень высокой также из-за опасности повредить биомолекулу на химическом уровне; чтобы избежать вторичного рассеивания электронов, нужны не просто тонкие образцы, а идеальный монослой изучаемых объектов. Кроме того, было ясно, что для записи изображений необходимы быстрые детекторы — биомолекулы способны менять форму или даже перемещаться из-за незначительного дрейфа температуры или взаимодействия с бомбардирующими их электронами.


Усилить сигнал и расшифровать

Во всяком случае, было понятно, что для изучения низкоконтрастных биоматериалов нужны электроны, обладающие как можно меньшей энергией, — именно это стимулировало поиск новых подходов к подготовке образцов. Первым шагом к существенному увеличению качества изображения был метод негативного контрастирования, разработанный в 1940-х годах и модифицированный в последующие два десятка лет («Journal of Applied Physics», 1945, 16, 459—465; doi: 10.1063/1.1707615. «Journal of Molecular Biology», 1965, 11, 403—423; doi: 10.1016/S0006-3495(89)82799-7). Метод основан на том, что биологический материал внедряют в тонкую аморфную пленку соли тяжелого металла (например, фосфата вольфрама), формирующую шаблон вокруг биомолекул (в точном соответствии с их формой). Этот шаблон рассеивает даже обладающие низкой энергией электроны лучше, чем находящийся внутри него биологический материал, он меньше повреждается потоком электронов и не дает биологическим молекулам менять форму во время их вакуумной сушки.

Негативное контрастирование образцов позволило получить детальную информацию о строении бактерий, вирусов и клеточных органоидов. Однако для более мелких объектов, например молекулярных комплексов, можно было получить в лучшем случае изображение «конверта», в который помещены биомолекулы (разрешение ограничено величиной зерна шаблона). И все же это был шаг вперед.

Вклад в адаптацию методов электронной микроскопии для биологических объектов внес в том числе и Аарон Клуг, получивший в 1982 году Нобелевскую премию по химии «за разработку метода кристаллографической электронной микроскопии и прояснение структуры биологически важных комплексов нуклеиновая кислота — белок». Он одним из первых пришел к тому, что для уточнения трехмерной структуры объекта, полученной с помощью метода негативного контрастирования, нужно сопоставить его двумерные проекции с различных сторон — это можно сделать, изменяя угол, под которым на образец направляется поток электронов. В 1960-х годах Клуг изучил таким образом тонкие кристаллы каталазы («Berichte der Bunsengesellschaft für physikalische Chemie», 1970, 74, 1129—1137; doi: 10.1002/bb pc.19700741109).

В 1968 году Клуг совместно с Давидом Дерозье сообщили о первом удачном примере: они вычислили трехмерную модель биологического объекта, исходя из двумерных проекций, полученных с помощью электронного микроскопа. Исследователи изучили хвост бактериофага T4 — его выбрали из-за спиралевидной симметрии, то есть для него трехмерную модель можно было построить, анализируя лишь одну двумерную проекцию, поскольку она одинакова под любыми углами («Nature», 1968, 217, 130-134; doi: 10.1038/217130a0).

Чтобы получить информацию о трехмерной структуре частиц, не обладающих спиралевидной симметрией, нужны комбинированные данные от нескольких двумерных проекций этих частиц. В 1970 году Клуг с Дерозье и Энтони Краутером разработали «подход общих линий», с помощью которого определили трехмерную структуру икосаэдрических капсидов вирусов («Proceedings of the Royal Society of London», 1970, A 317, 319—340; doi: 10.1098/rspa.1970.0119). В работе предполагалось, что аналогичный метод можно применить к несимметричным частицам, но все-таки более точные результаты он дает при анализе симметричных образцов.


Наблюдение не должно изменять объект

Еще один шаг к применению электронной микроскопии в биохимии был сделан, когда удалось сохранить в камере электронного микроскопа гидратированное состояние биомолекулы, а также сам анализируемый объект в целости и сохранности. Для этого Дональд Парсонс разработал конструкцию камер, в которых поддерживались определенная влажность и комнатная температура («Science», 1974, 186, 407—414; doi: 10.1126/science.186.4162.407). В этих камерах он исследовал кристаллы фермента каталазы и нашел условия, при которых облучение электронами не влияет на строение белка.

В 1970-е годы Роберт Глэзер смог количественно оценить степень повреждения кристаллической каталазы и низкомолекулярных органических соединений при облучении потоком электронов. Он пришел к выводу, что энергия излучения, способная повредить небольшое количество изучаемых объектов, равномерно распределится между большим количеством биомолекул одного и того же типа («Journal of Molecular Biology», 1975, 94, 425—432; doi: 10.1016/0022-2836(75)90212-0). Был еще один способ, который мог одновременно понизить скорость испарения воды и защитить биологический материал от повреждения электронным пучком, — охлаждение объекта. В 1950—1960-х годах Умберто Моран изучал возможности заморозки образцов и приготовления чрезвычайно тонких препаратов для крио-электронной микроскопии («Annals of the New York Academy of Sciences», 1960, 85, 689—713; doi: 10.1111/j.1749-6632.1960.tb49990.x). Однако вода обычно замерзает с образованием мельчайших кристалликов льда, на которых происходит дифракция электронов, а это сильно искажает сигналы, не говоря уже о том, что кристаллики могут изменить строение объекта. Базиль Люэ предложил снизить негативное влияние холода на биологические образцы, ускорив заморозку, — при этом вода затвердевает, формируя не кристаллическую, а аморфную твердую структуру. В 1960-е годы быструю заморозку применили для изучения белков с помощью рентгеноструктурного анализа. Образованию ледяных кристалликов также препятствует добавление в образец антифризов — сахарозы или глицерина («Acta Crystallographica B», 1970, 26, 998—1004; doi: 10.1107/S0567740870003485).

Чуть позже Глэзер и Кеннет Тейлор показали, что при быстрой заморозке можно с помощью электронной микроскопии рассмотреть кристаллы каталазы и получить картинку с разрешением в 3Å, не используя контрастирование. Доступная в то время технология заморозки позволяла проводить исследования при температуре выше –120оC — при этой температуре аморфный лед должен превращаться в кристаллический. Тем не менее в условиях эксперимента кристаллики льда не образовывались — как предположили исследователи, из-за того, что вода взаимодействует с поверхностью белка («Nature», 271, 1978, 659—660; doi: 10.1038/271659a0). Тейлор и Глэзер также придумали, как хранить биологические образцы при низких температурах, и доказали, что охлаждение образца увеличивает его информационную емкость.

После этого развитие методов, позволяющих изучать биомолекулы с помощью электронной микроскопии, на какое-то время прекратилось — до 1990-х годов существенных модификаций не было.


Нобелевские лауреаты 2017 года

pic_2017_11_07.jpg
2. Атомная модель бактериородопсина — трехмерная карта электронной плотности, наложенная на «срез». Информация получена с помощью криоэлектронной микроскопии

Однако человек устроен так, что ему всегда хочется большего. Начало 1990-х годов вполне можно считать вехой в развитии криоэлектронной микроскопии — Ричард Хендерсон с коллегами впервые продемонстрировал, что с ее помощью можно получить высококачественные изображения биологического объекта, совмещая и усредняя его разные изображения (рис. 2).

В своей первой работе Хендерсон получил качественную информацию о строении бактериородопсина, используя результаты сразу с нескольких электронных микроскопов, находящихся в различных научных центрах. При этом он оптимизировал информацию, полученную с каждого устройства («Journal of Molecular Biology», 1990, 213, 899—929; doi: 10.1016/S0022-2836(05)80271-2). В процессе обнаружился ряд технических ограничений, свойственных этим микроскопам, а также проблемы, связанные с приготовлением образцов. Хендерсон сделал вывод, что устройство электронных микроскопов и подготовку образцов надо принципиально изменить и тогда криоэлектронная микроскопия превратится в рутинный метод определения строения биологических препаратов. С его помощью можно будет изучать в том числе ассоциаты биомолекул, не обладающие кристаллической и симметричной структурой. Главная проблема исследования асимметричных частиц, которые располагаются без формирования дальнего порядка, в том, что трудно уловить слабый сигнал, который такая частица генерирует (измеряется соотношение сигнал-шум), и соответственно определить положение и ориентацию частицы в образце. Однако компьютерная техника, доступная исследователям в 1990 году, и не могла решить такую задачу («Journal of Structural Biology», 1999, 128, 3—14; doi: 10.1006/jsbi.1999.4172). В последующее десятилетие методы, подобные тем, что применил Хендерсон, использовали и другие группы ученых, они получили в том числе качественные изображения светопоглощающего комплекса хлорофилл-белок, тубулинового димера и аквапорина.

pic_2017_11_08.jpg

Примеры структур биологически активных соединений, изученных с помощью криоэлектронной микроскопии к маю 2016 года («Cell», 2016, 165, 1698—1707; doi: 10.1016/j.cell.2016.05.040)

Через пять лет после выхода статьи про структуру бактерио-родопсина Хендерсон представил детальный анализ задач, который требовалось решить для того, чтобы получать с высоким разрешением картинки ассоциатов биологически активных молекул, не формирующих кристаллические структуры («Quarterly Reviews of Biophysics», 1995, 28, 171—193; doi: 10.1017/S003358350000305X). Он сделал вывод, что нужно применять малоинтенсивное недеструктивное облучение электронами и использовать фазовый контраст, — это позволит определить двумерное положение индивидуальных частиц в плоскости двумерного кристалла и их трехмерную ориентацию. Правда, только в том случае, если частицы обладают достаточной молекулярной массой. Хендерсон считал, что для биомолекул и ассоциатов биомолекул с молекулярной массой больше 50 килодальтон можно получить образец с достаточным количеством частиц (около 10 000) и определить их строение с помощью электронной микроскопии с атомным разрешением ~3 Å. К началу XXI века Глэзер пришел к выводу, что минимальное значение молекулярной массы объекта, который можно проанализировать с разрешением в три ангстрема, — 20 килодальтон («Journal of Structural Biology», 1999, 128, 3—14; doi: 10.1006/jsbi.1999.4172). Правда, биомолекулы с такой молекулярной массой пока еще никому не удалось изучить, а самая легкая молекула, строение которой помог установить электронный микроскоп, — гемоглобин, 64 кДа («Nature Communications», 2017, 8, 16099; doi: 10.1038/ncomms16099). Но все-таки разрешение, с которым удается рассмотреть строение некоторых молекул, уже меньше 2 Å (рис. 3).

Второй нобелевский лауреат 2017 года, Йоахим Франк, еще в середине 1970-х годов стал заниматься фундаментальной проблемой изучения неконтрастированных, некристаллических асимметричных частиц, случайным образом ориентированных в растворе («Ultramicroscopy», 1975, 1, 159—162; doi: 10.1016/S0304-3991(75)80020-9). Франк полагал, что надо «создать условия для усиления тех признаков частиц, сигналы которых могут быть четко различимы на фоне значительных шумов».

В 1977 году Франк с коллегами описал, как обеспечить такое усиление — взаимной корреляцией сигналов от различных частиц («Ultramicroscopy», 1977, 2, 219—227; doi: 10.1016/S0304-3991(76)91385-1). Неупорядоченное расположение частиц можно определить с помощью пучков электронов, мощность которых недостаточна для разрушения объектов, и потом выстроить изображение с высоким разрешением, усреднив сигналы от каждой частицы. Решение было правильным, что и продемонстрировали при изучении строения фермента глутаминсинтетазы («Ultramicroscopy», 1978, 3, 283—290; doi: 10.1016/S0304-3991(78)80038-2).

В идеале для некристаллических образцов, состоящих из одинаковых частиц, требуется не так уж много информации, описывающей их положение в условной плоскости и ориентацию в трехмерном пространстве, — чтобы решить такую математическую задачу, требуется определить всего пять параметров. Однако реальные биологические системы отличаются от идеализированной математической модели тем, что образующие их частицы редко бывают совершенно одинаковыми и часто содержат примеси. Поэтому приходится создавать уточненные математические модели, которые учитывают неоднородность изучаемой системы, и создавать алгоритмы, сортирующие результаты исследования объекта и учитывающие, какие сигналы можно использовать далее для построения усредненной картины, а от каких следует избавиться. В 1981 году Франк с коллегами описал метод, позволяющий сортировать образы частиц на основании их ориентации в пространстве и особенностей строения («Ultramicroscopy», 1981, 6, 187—194; doi: 10.1016/0304­3991(81)90059-0). В этом же году он обобщил математические модели в компьютерной программе SPIDER (System for Processing Image Data from Electron microscopy and Related fields — система для обработки данных электронной микроскопии и связанных областей, «Ultramicroscopy», 1981, 6, 343—357; doi: 10.1016/S0304-3991(81)80236-7). Этот программный пакет для обработки изображений, полученных с помощью электронной микроскопии, существует и обновляется до сих пор (https://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html). Более того — программы бесплатные, что, безусловно, облегчает работу ученых во всем мире.

Как уже упоминалось, ученые ожидали, что быстрое охлаждение образца избавит электронную микроскопию от многих ограничений и позволит применять ее к биомолекулам. Проблему ледяных кристалликов планировали преодолеть с помощью быстрой заморозки, однако до 1980-х годов принципиальная возможность получения твердой стеклообразной воды была под вопросом — ученые думали, что необходимая для этого скорость охлаждения никогда не будет достигнута.

В 1980 году дискуссии на эту тему закрыли — исследователям удалось заморозить микрометровые капли воды, переведя ее в стеклообразное состояние («Nature», 1980, 288, 569—571; doi: 10.1038/288569a0). Годом позже Жак Дюбоше и Аласдер Макдауэлл получили тонкую пленку твердой некристаллической воды. Биообъекты, замороженные в такой пленке, можно будет изучать с помощью электронной микроскопии («Journal of Microscopy», 1981, 124, 3—4; doi: 10.1111/j.1365-2818.1981.tb02483.x).

pic_2017_11_09.jpg

Методика приготовления образца для криоэлектронной микроскопии

Метод заключался в следующем: воду распыляли на углеродную пленку, поверх которой была размещена сетка, и все быстро погружали в жидкий этан или пропан с температурой около –190оC (ее поддерживали за счет охлаждения жидким азотом). Оказалось, что тонкий слой стеклообразной твердой воды однородно поглощал электроны. От аморфного состояния воды к кристаллическому можно было перейти, нагревая образец до –140оC. В последующие годы Дюбоше усовершенствовал метод заморозки и приготовления образца для электронной микроскопии, а также описал результаты подробных исследований чистой воды, водных растворов и суспензий бактериофагов и молекул ДНК при криогенных температурах («Journal of Microscopy», 1982, 128, 219—237; doi: 10.1111/j.1365-2818.1982.tb04625.x).

Метод Дюбоше оценили в 1984 году, когда его группа опубликовала электронные микрографии суспензий вирусов («Nature», 1984, 308, 32—36; doi: 10.1038/308032a0). Методика позволяла получать достаточно тонкие слои воды для быстрого превращения в стеклообразное состояние, но при этом и достаточно толстые, чтобы в этом слое мог поместиться монослой биологически активных молекул или молекулярных комплексов в их естественной конформации (рис. 4).


Криоэлектронная микроскопия в наши дни

В последнее десятилетие существенно улучшились конструкционные элементы электронных микроскопов. Сейчас в них применяют новые детекторы, позволяющие регистрировать меньшее количество электронов, новые электронные пушки (источники электронов) и новые камеры, которые практически исключают колебания температуры, влияющие на точность исследования. Вся эта модернизация значительно повысила соотношение сигнал-шум и увеличила скорость анализа образца — в результате отдельные микрографии можно склеить в «фильм» из жизни молекул. Все это, как и предполагал Хендерсон в прошлом веке, превратило электронную микроскопию в распространенный и доступный метод исследования, применяющийся повсеместно, от материаловедения до исследования биологических систем.

Настоящий расцвет криоэлектронной микроскопии как метода для изучения биообъектов начинается с 2012—2013 годов и связан с появлением прямых электронных детекторов; с их помощью был, например, детально изучен ионный канал клеточной мембраны TRPV1 («Nature», 2013, 504, 107—112, doi: 10.1038/nature12822). И наконец, совсем недавно, в 2017 году, — всего через четыре года после опубликования первых статей, ставших основой для создания криоэлектронной микроскопии высокого разрешения, — этот метод позволил, как мы уже упоминали, исследовать молекулу гемоглобина в растворе («Nature Communications», 2017, 8, 16099; doi:10.1038/ncomms16099). Почти шесть десятилетий прошло с тех пор, как Джон Кендрю и Макс Перуц определили строение миоглобина и гемоглобина методом рентгеновской кристаллографии (именно благодаря этой работе в 1962 году они стали нобелевскими лауреатами).

За полвека пройден долгий путь. Для изучения биологической молекулы методом криоэлектронной микроскопии нет необходимости готовить ее кристаллический образец, а значит, для анализа требуется очень небольшое количество вещества. Метод позволяет анализировать частицы с массой в диапазоне от десятков килодальтон до нескольких мегадальтон. Разновидность метода — криоэлектронная томография может изучать и более крупные объекты, от комплекса биологически активных молекул до клеточного органоида и даже клетки. Криоэлектронная микроскопия изучает не только статичные структуры. Ионный фон, концентрацию низкомолекулярных веществ и рН охлаждаемого для анализа раствора можно систематически менять, что дает возможность определять структуру биообъектов в окружении, максимально близком к естественному. Метод криоэлектронной микроскопии даже делает видимыми изменения строения фермента, катализирующего реакцию («Nature», 2015, 521, 241—245; doi: 10.1038/nature14365). Практические приложения очевидны: детальное исследование биохимических процессов, изучение строения патогенных вирусов, создание новых и модификации существующих лекарственных препаратов.

В истории биохимических применений криоэлектронной микроскопии, вероятно, найдутся десятки имен, достойных упоминания. Однако лауреаты Нобелевской премии 2017 года — Жак Дюбоше, разработавший метод приготовления образцов для криоэлектронной микроскопии, Йоахим Франк, придумавший математические методы обработки сигналов от ансамблей частиц в растворах, и Ричард Хендерсон, впервые продемонстрировавший возможность применения криоэлектронной микроскопии для определения структур биомолекул с высоким разрешением, — действительно внесли огромный вклад в создание технологий для путешествий в глубины живой материи.

Разные разности

30.04.2018 10:00:00

...NASA откладывает запуск космического телескопа Джеймса Уэбба (JWST) почти на год, до мая 2020 года...

...в Баксанской нейтринной обсерватории ИЯИ РАН планируется создание нейтринного детектора на основе жидкого сцинтиллятора, который можно будет использовать как часть мировой сети таких детекторов для изучения внутреннего строения Земли...

...аэрозоль электронных сигарет вызывает повреждения ДНК в клетках легких, мочевого пузыря и сердца мышей, а также подавляет репарацию ДНК в легких...


>>
25.04.2018 10:00:00

Один из самых серьезных факторов риска развития возрастной деменции — вариант ε4 гена APOE. Тем не менее у 53% его носителей деменция так и не развивается, значит, дело в негенетических факторах. Группа американских ученых решила проверить, способен ли противодействовать угасанию умственных способностей позитивный настрой.

>>
18.04.2018 10:00:00

Авторы исследования, опубликованного в «Nature Human Behavior», ведовство изучать не собирались, их темой были сотрудничество и взаимопомощь в сельских общинах. Однако в процессе работы выяснилось, что в деревнях на юго-западе Китая, в провинции Сычуань, примерно 13,7% населения живет с прозвищем «чжу» или «чжубо» — злые колдуны.

>>
02.04.2018 10:00:00

...китайские ученые успешно клонировали приматов — макак-крабоедов Macaca fascicularis переносом ядра соматической клетки; 79 эмбрионов имплантировали 21 самке, в итоге родились два детеныша, Чжун-Чжун и Хуа-Хуа...

>>
29.03.2018 10:00:00

Все говорят об ультразвуковом общении дельфинов: ну как же — загадочные красивые существа, приматы моря, интересно, что у них за язык такой. Менее известно публике ультразвуковое пение мышей.

>>