Кому и зачем нужна люминесценция

После рассказа о научном результате всегда остается о чем поговорить с авторами открытия. Зачем живые организмы светятся, зачем ученые исследуют свечение, каковы дальнейшие перспективы... На вопросы «Химии и жизни» ответили соавторы статьи в «Angewandte Chemie», посвященной люциферину F. heliota. (См. предыдущую статью в этом номере.)

	Кандидат биологических наук Н.С.Родионова, научный сотрудник лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН		Кандидат физико-математических наук М.А.Дубинный, научный сотрудник лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН  .
	Кандидат биологических наук В.Н.Петушков, старший научный сотрудник лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН		Кандидат химических наук И.В.Ямпольский, руководитель группы синтеза природных соединений, научный сотрудник лаборатория биофотоники ИБХ РАН

После вручения нобелевской премии 2008 года за флуоресцентные белки много говорили об их преимуществах перед люциферин-люциферазной системой. Есть ли преимущества у люциферин-люциферазной системы перед флуоресцентными белками? 

М.Д. В живых организмах очень много флуоресцирующих компонентов, поэтому найти целевую флуоресценцию сложнее, чем свечение люциферина. Если же мы не подсвечиваем образец ультрафиолетом, но регистрируем свечение, это точно то, что нужно, — обычно живые организмы не светятся. Это означает чувствительность во много раз большую, чем у обычной флуоресценции.

И.Я. Иначе говоря, при регистрации флуоресценции всегда есть соотношение сигнал/шум, а у люминесценции шума почти нет. Преимущество по чувствительности — это первое, а второе — именно люминесценцию используют при высокопроизводительном скрининге (high throughput assay), например при поиске потенциальных лекарственных препаратов среди веществ-кандидатов, когда огромные роботы проводят много тысяч реакций одновременно.

То есть флуоресцентный белок удобнее внедрять в биологические системы, а люциферин-люциферазную систему использовать для тестов in vitro, тестов и для медицины и экологии?

М.Д. В общем, да.

И.Я. Одно из применений люминесценции — измерение концентрации АТФ.

Потому что люцифераза нуждается в АТФ для проведения реакции?

И.Я. Люцифераза светляка — да. Она была единственной АТФ-зависимой из семи ранее известных, наша оказалось второй. Можно взять десять тысяч образцов, добавить к ним люциферин-люциферазу и проверить концентрацию АТФ сразу во всех. На самом деле спектры приложений люциферин-люциферазной системы и флуоресцентных белков пересекаются, но не совпадают.

Осаму Шимомура часто рассказывает, как люминесценцию используют в качестве датчика кальция...

И.Я. Сначала надо было открыть систему, нуждающуюся в кальции. Из тех, которые хорошо изучены, это пока только экворин. Или похожие на него белки, как обелин.

Значит, каждая новая люциферин-люциферазная система — это потенциально новые применения?

И.Я. В принципе да. Но зато в чем преимущество флуоресценции перед люминесценцией: она более наглядна, с ее помощью можно разглядывать микроскопические структуры вплоть до одной молекулы и с помощью этого достигать очень высокого разрешения в микроскопии. С люминесценцией такое невозможно, к сожалению.

А чисто физические методы, такие как квантовые точки — конкуренты биологическим?

И.Я. С квантовыми точками проблема в том, чтобы селективно их доставить куда-либо. С флуоресцентным белком можно задействовать генно-инженерные и молекулярно-биологические подходы, чтобы локализовать его или в ядре, или в мембране. С квантовыми точками такой селективности до сих пор не достигнуто. Пытаются ее достичь, например привешивают к ним какие-то сигналы локализации — партнеры по связыванию, антитела. Но пока шум там огромный. В общем, у каждого метода своя область применения и свои ограничения.

Детский вопрос: какие есть гипотезы по поводу того, зачем животные светятся?

И.Я. Пока мы этого не знаем. Месяц назад я был в Швеции на конгрессе, посвященном люминесценции. Там кроме химиков были и биологи, которые пытаются ответить на этот вопрос. Я узнал для себя много нового, в частности что у биолюминесценции есть около 15 различных преимуществ.

Аналог предупреждающей окраски, привлечение партнера...

И.Я. Да, и отпугивание хищника. Но то, что мне понравилось и чего я не знал до этого, — оказывается, медуза начинает светиться, когда ее атакует рыбка. Медузы небольшие, и рыбы их едят не очень крупные, но большие рыбы, видя этот сигнал, приплывают и съедают хищника, который пытался съесть медузу. Эдит Уиддер из «Ocean Research & Conservation Association» (США) с коллегами сняла фильм для канала «Дискавери». Им удалось впервые заснять на видео гигантского кальмара. Для этого они опустили в океан светильник, похожий на медузу, с огоньками по кругу, и пришли в полный восторг, когда на него кинулся кальмар — огромный, с двухэтажный дом. Он думал, что это медуза светилась в ответ на атаку рыбы, и даже, насколько можно приписывать кальмару человеческие реакции, казался очень недовольным, что никакой рыбы не было.

А по поводу светящихся червей есть предположения, зачем им это нужно?

И.Я. В том числе и на этом конгрессе я спрашивал у биологов, но никто не смог мне этого сказать, даже специалисты.

При том, что светящихся червей известно довольно много?

М.Д. В наших лесах их два вида. Второй — из рода Henlea, про них мы еще не знаем, как они светятся.

Так есть еще и второй?!

В.П. Действительно, в тех же образцах почвы, которые мы в 89—90 годах собирали на биостанции, обнаружился и другой вид энхитреид (семейство малощетинковых червей, к которому принадлежат фридериции. — Примеч. ред.). Мы этого никак не ожидали, найти один-то светящийся вид было удачей, о двух даже мысли не было. Выбирали червей в темноте, промывали, рассматривали их внутренние органы под микроскопом, считали щетинки. Все сильно варьировало, но мы это списывали на наличие несветящихся червей, которые неизбежно попадаются в пробах. Мелких светящихся червей считали молодыми, тех, что покрупнее и потолще, — взрослыми. Чтобы все рассортировать, мы начали проверять червей в биолюминометре, помещая их по одному в кювету с водой, а потом смотрели под микроскопом. Но все еще больше запуталось. Наконец мы заметили, что после крупных червей светится сама вода в кювете, то есть что-то светящееся выделяется из них во внешнюю среду. А вот после тонких мелких светящихся червей вода не светится. В итоге у нас получились три группы: сорные несветящиеся, мелкие тонкие светящиеся и более крупные толстенькие светящиеся черви, которые вдобавок еще и выделяют светящуюся слизь. И по количеству щетинок, и по виду внутренних органов светящиеся черви оказались разными. Два вида! Это было потрясающе.

Н.Р. Позже мы сделали первые снимки. Валентин придумал оригинальный способ — червя просто прижимали пальцем через целлофан к фотопленке в темноте на определенное время, потом проявляли. На снимках тоже отчетливо было видно: тонкие черви, получившие позже имя Fridericia heliota, имели светящиеся точки на теле, а толстые, отнесенные нами к роду Henlea, выпускали светящееся облако слизи.

У Henlea тоже люциферин-люциферазная система?

Н.Р. Да, но биолюминесцентные системы у них разные. Кроме люциферина, люциферазы и кислорода, для биолюминесценции Henlea нужен кальций (в случае Fridericia heliota — АТФ и магний). Точный вид светящейся хенлеи еще не установлен. Есть три вида этого рода, наиболее близких к нашей по описанию, но ни с одним нет полного совпадения. Биолюминесценция не отмечена ни у одного из них, ведь «нормальные» ученые делали их описание при свете дня.

В.П. В лесах Красноярского края хенлеи попадаются редко: в удачных местах примерно одна к ста фридерициям. Но в одной старой статье, 1929 года, мы встретили описание очень похожего червя — Henlea irkutensis, правда, про свечение не было ни слова. Съездили в Иркутскую область и там действительно нашли наших хенлей, на которых потом сделали ряд экспериментов, сравнили две биолюминесцентные системы и опубликовали результаты в «Докладах Академии наук». Основная же работа велась по теме Fridericia heliota.

Так вот, возвращаясь к биологической целесообразности...

М.Д. По поводу целесообразности: любая люминесцентная система сначала возникает, а потом находит применение.

И.Я. Это, как известно, одна из трудностей эволюционной теории, которые отмечал еще сам Дарвин, причем именно биолюминесценцию он и привел в качестве примера. Этот признак, казалось бы, не может появиться постепенно: свечение или есть, или его нет. Но если признак не проявлялся фенотипически, то как он мог сформироваться под воздействием отбора?

Обычно на это отвечают, что на ранних стадиях формирования он был нужен для чего-то другого.

И.Я. Но в данном случае совсем не очевидно, для чего. Есть версии, например защита от активных форм кислорода, но для меня не слишком убедительные.

М.Д. Мне кажется, раньше для чего-то мог быть нужен продукт окисления. То, что червяки светятся на любое воздействие, при любой активности, подтверждает эту гипотезу: активируется метаболизм, включается свет. Но точного ответа мы не знаем.

Максим, расскажите, как вы стали участником этой работы Кто обращается к вам в лабораторию ЯМР-спектроскопии с просьбой определить структуру?

М.Д. Основная работа нашей лаборатории — установление структуры белков, причем обычно мембранных — это самая сложная структурная работа. Мембранные белки нельзя просто растворить в воде, они плохо кристаллизуются, поэтому рентгеноструктурный анализ мало помогает. К белку приходится добавлять модель мембраны, размер комплекса становится больше, это для ЯМР хуже. Такие комплексы менее стабильны, все время норовят выпасть из раствора в осадок. Рекомбинантные белки получить тоже трудно, потому что они не растворяются в самой клетке. Но, несмотря на методические сложности, мы эту тему двигаем. А иногда нас просят определить структуру какого-нибудь маленького соединения.

Первый наш вопрос: а почему этим стоит заниматься, чем это полезно? Очень хорошо, когда приходят люди, которые нашли какое-то активное соединение — уже выделили его, очистили, показали его активность. Они не могут гарантировать, что это соединение еще не известно науке, потому что это мы должны сказать, известно оно или нет. Но они говорят: у нас вещество, которое светится, или блокирует болевые рецепторы, или делает еще что-то интересное. Понятно, что на это стоит потратить время.

Будут ли новые исследования люминесцентных веществ?

В.П. Конечно. Теперь, когда у нас есть огромный опыт с Fridericia heliota и отличная команда, думаем, нам удастся разобраться и с биолюминесценцией хенлеи.

И.Я. Не будем забегать вперед, но мы уже сейчас занимаемся другими люминесцентными системами. В частности, есть люминесцентная система грибов, к которой люди уже сто лет пытаются подступиться. У нас уже имеются первые структурные данные, которые мы сейчас готовим к публикации.

Даже не спрашиваю, зачем грибам нужна люминесценция...

И.Я. Этого никто пока не знает, убедительных экспериментов нет. Но поскольку грибы светятся не так ярко, как те же червяки, то, возможно, здесь как раз это побочный эффект какой-то другой реакции. Тем более что у грибов люминесценция не такая, как у медуз и червяков: у них можно зафиксировать все переходные состояния от полного нуля до довольно-таки яркого света.

Как сейчас, после завершения мегагранта, обстоят дела с финансированием?

И.Я. На то, чтобы просто работать, есть деньги. Но денег много не бывает, мы боремся постоянно.

Вы не пробовали подавать на грант российского научного фонда?

И.Я. Я подавал именно на эту тему и получил отказ. Отзыв одного эксперта был положительный, а другой рассудил достаточно оригинально: у авторов отличные публикации, значит, там уже все сделано, зачем им еще давать денег?

В.П. Мы сейчас попытаемся получить грант РФФИ. Посмотрим, удастся ли.

Беседовала Е.Клещенко.