Логистика под микроскопом

Нобелевскую премию по физиологии и медицине получили Джеймс Ротман (Йельский университет), Рэнди Шекман (Университет штата Калифорния, Беркли; Медицинский институт Говарда Хьюза) и Томас Зюдоф (Медицинский институт Говарда Хьюза, Стэнфорский университет) «за открытие системы везикулярного транспорта — основной транспортной системы в наших клетках».

Эукариотическая клетка устроена намного сложнее, чем бактериальная (см. статью «Происхождение эукариот» в этом же номере). Главное отличие состоит в том, что она разделена мембранами на отсеки — компартменты. Двойной мембраной окружено ядро — хранилище ДНК, архив генетической информации. Здесь распаковываются нужные в данный момент гены, информация переписывается с них на матричную РНК. Вокруг ядра — лабиринт эндоплазматического ретикулума. Сюда попадают молекулы мРНК, и рибосомы синтезируют на них аминокислотные цепочки белков. Reticulum по-латыни «сеточка» — на клеточных срезах эти мембраны, окружающие ядро, действительно похожи на сеть. Еще ближе к периферии располагаются плоские цистерны комплекса Гольджи (аппарата Гольджи) — складские помещения, где хранятся и сортируются биомолекулы, прежде чем занять свое место в архитектуре клетки или отправиться за ее пределы. Кроме того, белки в аппарате Гольджи подвергаются различным модификациям, «созревают». В цитоплазме перемещаются небольшие пузырьки лизосом — мусороперерабатывающие заводы клетки. Лизосомы содержат кислый раствор с ферментами, разрушающими белки, углеводы, липиды и нуклеиновые кислоты. Митохондрии и (у растений) хлоропласты — бывшие симбионты клетки, а теперь ее энергетические станции и фабрики по производству сахаров из углекислого газа. Разделение клетки на изолированные отсеки, или компартментализация — важнейшее достижение эукариот. Эффективность и безопасность лизосомы или митохондрии напрямую связаны с тем, что они не сообщаются с цитоплазмой.

Естественно задать вопрос: а где в этих отсеках двери? Допустим, в ядерной мембране есть крупные поры. Но каким образом белок попадает из эндоплазматического ретикулума в комплекс Гольджи, а оттуда — наружу, за внешнюю мембрану, если это, например, гормон, который должен секретироваться?

Ответ можно было увидеть еще в середине прошлого века на электронных микрофотографиях. Когда нужно переправить вещество из отсека в отсек, мембрана выпячивается и образует пузырек, который плывет к другой мембране и сливается с ней, выплескивая содержимое по другую сторону — в другом отсеке или за пределами клетки. (Конечно, электронная микроскопия показывала этот процесс стоп-кадрами, а не в режиме реального времени. Были даже споры, действительно ли эти мембранные кружочки — пузырьки или, может быть, срезы трубочек.) «Пузырек» по-латыни «везикула», отсюда «везикулярный транспорт».

Возможно, лучшее описание этих процессов — «Путешествие в мир живой клетки» Кристиана Де Дюва, получившего Нобелевскую премию 1976 года за открытия важнейших клеточных структур вместе с Джорджем Паладе и Альбером Клодом. Эта замечательная научно-популярная книга вышла на русском языке в 1987 году, и несколько поколений будущих биологов увлеченно следило за похождениями наноразмерного дайвера, посещающего мембранные лабиринты клетки. Вот, например, как он пишет о выбросе секретируемого вещества наружу — экзоцитозе, с точки зрения путешественника, сидящего в пузырьке. «Когда же наконец открывается выход из клетки, то это происходит с необыкновенной стремительностью. Экзоцитарная разгрузка секреторных гранул представляет собой взрывной процесс. Гранулы скапливаются и толкают друг друга, стремясь возможно скорее попасть на периферию клетки. (...) И вот уже обратно в целительное, успокаивающее внеклеточное море, где мы вновь созерцаем покрытую углублениями движущуюся поверхность клеточной мембраны с ее извивающимися отростками и колышащейся вуалью...» Де Дюв, вероятно, одобрил бы решение Нобелевского комитета в этом году. Не дожил он совсем немного: в мае, в возрасте 95 лет, добровольно ушел из жизни (в Бельгии разрешена эвтаназия).

Транспортные потоки в клетке (рисунок из книги Кристиана де Дюва)

Общее представление о пузырьковом транспорте нужно было конкретизировать. Одним из самых важных вопросов было: как пузырек находит свою цель? Мембран в клетке много, откуда везикула знает, с какой из них надо слиться, а с какой — ни в коем случае, чтобы не выплеснуть нужный фермент в мусорный бак лизосомы?

Читатель, знакомый с молекулярной и клеточной биологией, сразу ответит: наверное, в мембранах есть какие-то белки, которые специфически связываются друг с другом? В самую точку. Открытие этих белков, изучение их работы — заслуга лауреатов 2013 года.

Начиналось это в 70-е годы — никаких банков генных и белковых последовательностей, технологии секвенирования ДНК в зачаточном состоянии. Рэнди Шекман работал с лабораторными штаммами дрожжей — их клетки выделяют гликопротеины во внешнюю среду, но при некоторых мутациях не могут этого делать, секреторные пузырьки накапливаются в цитоплазме. (Вообще-то такие мутанты должны сразу погибать, но бывают формы, у которых мутация проявляет себя лишь при определенных температурах, для нормальных дрожжей не опасных: такую линию можно разводить в лаборатории.) Шекман собрал коллекцию мутантов с нарушениями на разных стадиях везикулярного транспорта и определил более двадцати генов, отвечающих за этот процесс. Что касается слияния мембраны с мембраной, были на особом подозрении два гена, sec17 и sec18.

Примерно тогда же, в 70—90-е годы, Джеймс Ротман изучал везикулярный транспорт в клетках млекопитающих. Для этого он развивал метод «восстановления in vitro» (in vitro reconstitution) — своего рода промежуточный этап между биохимией клетки и биохимией отдельных молекул, опыты с изолированными внутриклеточными структурами, к которым легко добавлять активные вещества и которые можно детально исследовать, «разбирая на части». Он работал с препаратами клеток, зараженных вирусом везикулярного стоматита. (Вирус получил название от совсем других пузырьков: тех, что по- являются на слизистой оболочке рта больного.) Для Ротмана вирус стоматита был удобен тем, что заставляет клетку производить и выводить наружу свой белок, тем же путем, что ее собственные белки внешней мембраны. При этом белок транспортировался из эндоплазматического ретикулума в комплекс Гольджи происходило опять-таки только при определенной температуре — когда аминокислотная цепочка белка была правильно уложена, следовательно, транспорт можно было запустить в удобное время.

Ротман изучал перемещения вирусного белка из компартмента в компартмент, образование секреторных везикул и их слияние с мембраной. Ему удалось выделить белки, вовлеченные в эти процессы. Среди них оказались два белка, гомологичных продуктам дрожжевых sec18 и sec17, — их назвали NSF (N-ethylmaleimide-sensitive factor) и SNAP (soluble NSF-attachment protein). Шекман и Ротман с соавторами в 1992 году опубликовали совместную работу, где описывали клонирование sec17 и подтверждали эквивалентность его продукта и SNAP. Это значило, что подобные белки были еще у общего предка млекопитающих и дрожжей и что они весьма важны для клетки. И неудивительно: что может быть важнее транспорта?

Используя два первых белка как «наживку», Ротман идентифицировал в тканях мозга млекопитающих другие белки, получившие общее название SNARE (SNAP receptor). Сами белки были известны и ранее, но Ротман доказал, что они отвечают за слияние мембран. Три из них — SNAP-25, синтаксин и VAMP, он же синаптобревин — были найдены в равных количествах; это говорило о том, что они что-то делают вместе. Синаптобревин содержался в мембране везикул, синтаксин и SNAP-25 — в плазматической мембране. Теперь мы знаем, как именно они взаимодействуют, подтягивая пузырек к мембране, точно причальные канаты корабль к пристани. (Белок NSF на рисунке не показан; есть мнение, что он разделяет SNARE-комплекс, когда слияние мембран завершено.) В разных мембранах — разные SNARE, так обеспечивается точная доставка пузырьковых посылок по адресу.

Перед тем как перейти к работам третьего лауреата, Томаса Зюдофа, спросим, почему Ротман искал белки в тканях мозга? Да потому, что там везикулярный транспорт играет важнейшую роль: обеспечивает передачу сигнала от нейрона к нейрону через синапс. Если вдоль нервного окончания сигнал передается за счет быстрого изменения потенциала на мембране, то от клетки к клетке — старым добрым способом: одна клетка выбрасывает вещество, которое взаимодействует с рецепторами другой.

Участок, где окончание передающего нейрона тесно контактирует с мембраной принимающего, называется синапсом, промежуток между мембранами — синаптической щелью. В эту щель везикулы первого нейрона выбрасывают нейромедиаторы. Рецепторы на мембране второго нейрона взаимодействуют с ними, и это служит знаком — срочно разрядить собственную мембрану, передавать сигнал дальше. (Или наоборот, не разряжать мембрану, не реагировать на другие возбуждающие сигналы — медиаторы бывают и тормозными.)

Понятно, что выбрасывать медиатор надо в строго определенный момент, с точностью до долей миллисекунды. Де Дюв не зря пишет о стремительности экзоцитоза. Каким образом он запускается точно вовремя, объяснил Томас Зюдоф. Известно было, что это как-то связано с внутриклеточной концентрацией ионов кальция, с активностью каналов, пропускающих Ca²⁺ внутрь нейрона. Зюдоф обнаружил два белка, комплексин и синаптотагмин, которые выступают посредниками между ионами кальция и комплексом SNARE. У мышей с неактивным геном комплексина высвобождение медиатора из нервных окончаний неэффективно из-за нечувствительности к кальцию. Причина в том, что этот белок препятствует слиянию мембран до кальциевого сигнала. Синаптотагмин же в присутствии кальция взаимодействует с фосфолипидами мембраны, а также с белками SNARE, заменяя комплексин и тем самым давая команду к слиянию. Зюдоф также обнаружил SM-белок, взаимодействующий с синтаксином, — первый представитель еще одной группы белков, необходимой для секреции нейромедиаторов.

О некоторых примерах практического использования открытий лауреатов мы расскажем в следующем материале. Здесь только заметим, что белки SNARE — мишени токсинов ботулизма и столбняка, с нарушениями везикулярного транспорта связаны развитие диабета второго типа и некоторые формы врожденной эпилепсии. И конечно, нельзя забывать о фундаментальном значении этих открытий. Мы живем и мыслим благодаря маленьким пузырькам в наших клетках.