Логистика под микроскопом

Клещенко Е.
(«ХиЖ», 2013, №11)

Нобелевскую премию по физиологии и медицине получили Джеймс Ротман (Йельский университет), Рэнди Шекман (Университет штата Калифорния, Беркли; Медицинский институт Говарда Хьюза) и Томас Зюдоф (Медицинский институт Говарда Хьюза, Стэнфорский университет) «за открытие системы везикулярного транспорта — основной транспортной системы в наших клетках».


s20131112 logistika1.jpgЭукариотическая клетка устроена намного сложнее, чем бактериальная (см. статью «Происхождение эукариот» в этом же номере). Главное отличие состоит в том, что она разделена мембранами на отсеки — компартменты. Двойной мембраной окружено ядро — хранилище ДНК, архив генетической информации. Здесь распаковываются нужные в данный момент гены, информация переписывается с них на матричную РНК. Вокруг ядра — лабиринт эндоплазматического ретикулума. Сюда попадают молекулы мРНК, и рибосомы синтезируют на них аминокислотные цепочки белков. Reticulum по-латыни «сеточка» — на клеточных срезах эти мембраны, окружающие ядро, действительно похожи на сеть. Еще ближе к периферии располагаются плоские цистерны комплекса Гольджи (аппарата Гольджи) — складские помещения, где хранятся и сортируются биомолекулы, прежде чем занять свое место в архитектуре клетки или отправиться за ее пределы. Кроме того, белки в аппарате Гольджи подвергаются различным модификациям, «созревают». В цитоплазме перемещаются небольшие пузырьки лизосом — мусороперерабатывающие заводы клетки. Лизосомы содержат кислый раствор с ферментами, разрушающими белки, углеводы, липиды и нуклеиновые кислоты. Митохондрии и (у растений) хлоропласты — бывшие симбионты клетки, а теперь ее энергетические станции и фабрики по производству сахаров из углекислого газа. Разделение клетки на изолированные отсеки, или компартментализация — важнейшее достижение эукариот. Эффективность и безопасность лизосомы или митохондрии напрямую связаны с тем, что они не сообщаются с цитоплазмой.

Естественно задать вопрос: а где в этих отсеках двери? Допустим, в ядерной мембране есть крупные поры. Но каким образом белок попадает из эндоплазматического ретикулума в комплекс Гольджи, а оттуда — наружу, за внешнюю мембрану, если это, например, гормон, который должен секретироваться?

Ответ можно было увидеть еще в середине прошлого века на электронных микрофотографиях. Когда нужно переправить вещество из отсека в отсек, мембрана выпячивается и образует пузырек, который плывет к другой мембране и сливается с ней, выплескивая содержимое по другую сторону — в другом отсеке или за пределами клетки. (Конечно, электронная микроскопия показывала этот процесс стоп-кадрами, а не в режиме реального времени. Были даже споры, действительно ли эти мембранные кружочки — пузырьки или, может быть, срезы трубочек.) «Пузырек» по-латыни «везикула», отсюда «везикулярный транспорт».

Возможно, лучшее описание этих процессов — «Путешествие в мир живой клетки» Кристиана Де Дюва, получившего Нобелевскую премию 1976 года за открытия важнейших клеточных структур вместе с Джорджем Паладе и Альбером Клодом. Эта замечательная научно-популярная книга вышла на русском языке в 1987 году, и несколько поколений будущих биологов увлеченно следило за похождениями наноразмерного дайвера, посещающего мембранные лабиринты клетки. Вот, например, как он пишет о выбросе секретируемого вещества наружу — экзоцитозе, с точки зрения путешественника, сидящего в пузырьке. «Когда же наконец открывается выход из клетки, то это происходит с необыкновенной стремительностью. Экзоцитарная разгрузка секреторных гранул представляет собой взрывной процесс. Гранулы скапливаются и толкают друг друга, стремясь возможно скорее попасть на периферию клетки. (...) И вот уже обратно в целительное, успокаивающее внеклеточное море, где мы вновь созерцаем покрытую углублениями движущуюся поверхность клеточной мембраны с ее извивающимися отростками и колышащейся вуалью...» Де Дюв, вероятно, одобрил бы решение Нобелевского комитета в этом году. Не дожил он совсем немного: в мае, в возрасте 95 лет, добровольно ушел из жизни (в Бельгии разрешена эвтаназия).


s20131112 logistika2.jpg
Транспортные потоки в клетке (рисунок из книги Кристиана де Дюва)


Общее представление о пузырьковом транспорте нужно было конкретизировать. Одним из самых важных вопросов было: как пузырек находит свою цель? Мембран в клетке много, откуда везикула знает, с какой из них надо слиться, а с какой — ни в коем случае, чтобы не выплеснуть нужный фермент в мусорный бак лизосомы?

Читатель, знакомый с молекулярной и клеточной биологией, сразу ответит: наверное, в мембранах есть какие-то белки, которые специфически связываются друг с другом? В самую точку. Открытие этих белков, изучение их работы — заслуга лауреатов 2013 года.

Начиналось это в 70-е годы — никаких банков генных и белковых последовательностей, технологии секвенирования ДНК в зачаточном состоянии. Рэнди Шекман работал с лабораторными штаммами дрожжей — их клетки выделяют гликопротеины во внешнюю среду, но при некоторых мутациях не могут этого делать, секреторные пузырьки накапливаются в цитоплазме. (Вообще-то такие мутанты должны сразу погибать, но бывают формы, у которых мутация проявляет себя лишь при определенных температурах, для нормальных дрожжей не опасных: такую линию можно разводить в лаборатории.) Шекман собрал коллекцию мутантов с нарушениями на разных стадиях везикулярного транспорта и определил более двадцати генов, отвечающих за этот процесс. Что касается слияния мембраны с мембраной, были на особом подозрении два гена, sec17 и sec18.

Примерно тогда же, в 70—90-е годы, Джеймс Ротман изучал везикулярный транспорт в клетках млекопитающих. Для этого он развивал метод «восстановления in vitro» (in vitro reconstitution) — своего рода промежуточный этап между биохимией клетки и биохимией отдельных молекул, опыты с изолированными внутриклеточными структурами, к которым легко добавлять активные вещества и которые можно детально исследовать, «разбирая на части». Он работал с препаратами клеток, зараженных вирусом везикулярного стоматита. (Вирус получил название от совсем других пузырьков: тех, что по- являются на слизистой оболочке рта больного.) Для Ротмана вирус стоматита был удобен тем, что заставляет клетку производить и выводить наружу свой белок, тем же путем, что ее собственные белки внешней мембраны. При этом белок транспортировался из эндоплазматического ретикулума в комплекс Гольджи происходило опять-таки только при определенной температуре — когда аминокислотная цепочка белка была правильно уложена, следовательно, транспорт можно было запустить в удобное время.

Ротман изучал перемещения вирусного белка из компартмента в компартмент, образование секреторных везикул и их слияние с мембраной. Ему удалось выделить белки, вовлеченные в эти процессы. Среди них оказались два белка, гомологичных продуктам дрожжевых sec18 и sec17, — их назвали NSF (N-ethylmaleimide-sensitive factor) и SNAP (soluble NSF-attachment protein). Шекман и Ротман с соавторами в 1992 году опубликовали совместную работу, где описывали клонирование sec17 и подтверждали эквивалентность его продукта и SNAP. Это значило, что подобные белки были еще у общего предка млекопитающих и дрожжей и что они весьма важны для клетки. И неудивительно: что может быть важнее транспорта?

s20131112 logistika3.jpgИспользуя два первых белка как «наживку», Ротман идентифицировал в тканях мозга млекопитающих другие белки, получившие общее название SNARE (SNAP receptor). Сами белки были известны и ранее, но Ротман доказал, что они отвечают за слияние мембран. Три из них — SNAP-25, синтаксин и VAMP, он же синаптобревин — были найдены в равных количествах; это говорило о том, что они что-то делают вместе. Синаптобревин содержался в мембране везикул, синтаксин и SNAP-25 — в плазматической мембране. Теперь мы знаем, как именно они взаимодействуют, подтягивая пузырек к мембране, точно причальные канаты корабль к пристани. (Белок NSF на рисунке не показан; есть мнение, что он разделяет SNARE-комплекс, когда слияние мембран завершено.) В разных мембранах — разные SNARE, так обеспечивается точная доставка пузырьковых посылок по адресу.

Перед тем как перейти к работам третьего лауреата, Томаса Зюдофа, спросим, почему Ротман искал белки в тканях мозга? Да потому, что там везикулярный транспорт играет важнейшую роль: обеспечивает передачу сигнала от нейрона к нейрону через синапс. Если вдоль нервного окончания сигнал передается за счет быстрого изменения потенциала на мембране, то от клетки к клетке — старым добрым способом: одна клетка выбрасывает вещество, которое взаимодействует с рецепторами другой.

Участок, где окончание передающего нейрона тесно контактирует с мембраной принимающего, называется синапсом, промежуток между мембранами — синаптической щелью. В эту щель везикулы первого нейрона выбрасывают нейромедиаторы. Рецепторы на мембране второго нейрона взаимодействуют с ними, и это служит знаком — срочно разрядить собственную мембрану, передавать сигнал дальше. (Или наоборот, не разряжать мембрану, не реагировать на другие возбуждающие сигналы — медиаторы бывают и тормозными.)

Понятно, что выбрасывать медиатор надо в строго определенный момент, с точностью до долей миллисекунды. Де Дюв не зря пишет о стремительности экзоцитоза. Каким образом он запускается точно вовремя, объяснил Томас Зюдоф. Известно было, что это как-то связано с внутриклеточной концентрацией ионов кальция, с активностью каналов, пропускающих Ca2+ внутрь нейрона. Зюдоф обнаружил два белка, комплексин и синаптотагмин, которые выступают посредниками между ионами кальция и комплексом SNARE. У мышей с неактивным геном комплексина высвобождение медиатора из нервных окончаний неэффективно из-за нечувствительности к кальцию. Причина в том, что этот белок препятствует слиянию мембран до кальциевого сигнала. Синаптотагмин же в присутствии кальция взаимодействует с фосфолипидами мембраны, а также с белками SNARE, заменяя комплексин и тем самым давая команду к слиянию. Зюдоф также обнаружил SM-белок, взаимодействующий с синтаксином, — первый представитель еще одной группы белков, необходимой для секреции нейромедиаторов.

О некоторых примерах практического использования открытий лауреатов мы расскажем в следующем материале. Здесь только заметим, что белки SNARE — мишени токсинов ботулизма и столбняка, с нарушениями везикулярного транспорта связаны развитие диабета второго типа и некоторые формы врожденной эпилепсии. И конечно, нельзя забывать о фундаментальном значении этих открытий. Мы живем и мыслим благодаря маленьким пузырькам в наших клетках.

Разные разности

30.04.2018 10:00:00

...NASA откладывает запуск космического телескопа Джеймса Уэбба (JWST) почти на год, до мая 2020 года...

...в Баксанской нейтринной обсерватории ИЯИ РАН планируется создание нейтринного детектора на основе жидкого сцинтиллятора, который можно будет использовать как часть мировой сети таких детекторов для изучения внутреннего строения Земли...

...аэрозоль электронных сигарет вызывает повреждения ДНК в клетках легких, мочевого пузыря и сердца мышей, а также подавляет репарацию ДНК в легких...


>>
25.04.2018 10:00:00

Один из самых серьезных факторов риска развития возрастной деменции — вариант ε4 гена APOE. Тем не менее у 53% его носителей деменция так и не развивается, значит, дело в негенетических факторах. Группа американских ученых решила проверить, способен ли противодействовать угасанию умственных способностей позитивный настрой.

>>
18.04.2018 10:00:00

Авторы исследования, опубликованного в «Nature Human Behavior», ведовство изучать не собирались, их темой были сотрудничество и взаимопомощь в сельских общинах. Однако в процессе работы выяснилось, что в деревнях на юго-западе Китая, в провинции Сычуань, примерно 13,7% населения живет с прозвищем «чжу» или «чжубо» — злые колдуны.

>>
02.04.2018 10:00:00

...китайские ученые успешно клонировали приматов — макак-крабоедов Macaca fascicularis переносом ядра соматической клетки; 79 эмбрионов имплантировали 21 самке, в итоге родились два детеныша, Чжун-Чжун и Хуа-Хуа...

>>
29.03.2018 10:00:00

Все говорят об ультразвуковом общении дельфинов: ну как же — загадочные красивые существа, приматы моря, интересно, что у них за язык такой. Менее известно публике ультразвуковое пение мышей.

>>