Пути-дороги полимеразной цепной реакции

Электронная микрофотография молекулы ДНК, предоставленная сотрудниками лаборатории структуры и морфогенеза вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского

Куда ведет дорога

Разыскивается преступник. Он смертельно опасен. Он скоро создаст банду подобных себе, которые выйдут на большую дорогу и начнет убивать. Но он затерялся в многомиллионном сообществе и ускользает от всех проверок.

Есть фотография преступника, известны особые приметы. Надо его опознать. Включается печатный станок, и информация о нем расходится во множестве копий. Теперь успех почти гарантирован.

Этот преступник — вирус. Вызывает ли он СПИД, рак или простой гепатит, ведет он себя именно так. Вирус — это нуклеиновая кислота в белковой оболочке. Его гены, кодирующие поверхностные белки, часто мутируют, вирус как бы меняет паспорт, по которому его узнает иммунная система организма. Поэтому против ВИЧ до сих пор не создана вакцина. Поэтому же иммуноферментные методы диагностики не всегда срабатывают. Есть у вируса и менее изменчивые белки, но они расположены глубже, и до них нелегко добраться.

Когда вирус попадает в клетку, он скидывает белковую оболочку и его гены встраиваются в клеточный геном. Через некоторое время клетка станет синтезировать частицы вируса вместо своих белков. Пока этого не произошло, в латентном периоде, вирус желательно обнаружить, если не для того, чтобы убить, то хотя бы для того, чтобы предупредить заражение других людей. Искать, конечно, нужно константные кусочки вирусных генов, кодирующие малоизменчивые участки белков. Но как их найти среди миллионов других генов?

Пойдем по пути правоохранительных органов. Чтобы выявить врага, его надо скопировать и копии размножить.

О пользе хороших дорог

У клетки есть механизм, копирующий наследственную информацию. Специальные ферменты, геликазы (от helix — спираль), расплетают двойную спираль ДНК. Напомню, что две ее цепи антипараллельны и у каждой есть так называемые 3'- и 5'-концы. Другой фермент — ДНК-полимераза — опознает азотистые основания в цепочке-матрице и наращивает от 5'- к З'-концу вторую цепочку ДНК, делая нечто вроде негатива из комплементарных нуклеотидов. Для того чтобы процесс пошел, в среде должен быть строительный материал — свободные нуклеотиды. Но этого мало. ДНК-полимераза не начинает работать на голом месте. Она берется за дело, только когда вбит первый колышек — к цепи ДНК присоединился праймер. Праймер — это небольшая цепочка из нуклеотидов, служащая затравкой для синтеза новой цепи. С матрицей она соединяется комплементарно, причем, чем больше нуклеотидов в праймере, тем специфичнее это происходит, то есть точнее выбирется антипоследовательность. Короткие олигонуклеотиды часто ошибаются.
Теоретически ДНК-полимераза снимает копию с матрицы до самого З'-конца. В действительности она по разным причинам обычно срывается. Одна из важных характеристик полимераз (а есть несколько типов этих белков) показывает, какой длины участки, в среднем, конечно, может копировать этот фермент. Несколько сот нуклеотидов — слабо, десятки тысяч — очень неплохо.

1. Так проходят первые три цикла ПЦР. Полимераза удваивает цепи ДНК, обозначенные стрелками (1—3'-конец, 2—5'-конец), начиная с праймеров З и 4 (разными цветами обозначены плюс- и минус-цепи). После первого удвоения получаются цепочки, ограниченные с одной стороны выделенного участка а, после второго — копии необходимой длины. Дальше они будут накапливаться в геометрической прогрессии.

Как скопировать участок ДНК, начинающийся в нужном месте? Зная последовательность оснований на его границе, синтезируют праймер-антипоследовательность (аденин вместо гуанина, тимин вместо цитозина и так далее) из десятка-двух нуклеотидов. Больше — хорошо бы, но сложно, меньше — специфичность мала. Добавляют их к препарату расплетенной ДНК, и они связываются с родственным участком. С этого места и начнет работать фермент-копировщик. Но ведь ему не подашь сигнал «стоп», чтобы ограничить нужный участок с другой стороны, с З'-конца. Отрезать лишнее можно при втором проходе. Копия антипараллельна, и по ней ДНК-полимераза пойдет в обратную сторону. А откуда ей начинать? С праймера ко второму граничному участку. (Он, естественно, должен быть антиантипоследовательностью, то есть таким же, как в матрице.) Дойдя до конца, который был началом в предыдущем проходе, фермент уже во втором цикле выдает точную копию избранного участка (рис. 1). Полимераза скопирует ее в следующем цикле, потом обе копии, старую и новую, потом четыре и так далее до 2^n-1, где n — номер цикла. Продукты предыдущего копирования инициируют последующее. Это называется полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Конечно, будут и отходы — копии с длинными хвостами с одной и другой стороны. Но если полимеразу заставлять работать еще и еще, их доля будет все меньше и меньше. После 20 циклов копий нужного участка будет около миллиона, а других — несколько десятков.

С точки зрения химика, молекулярная биология — нонсенс, ведь для него одно из главных понятий — концентрация. Как можно изучать химию нескольких молекул? Речь идет даже не об уникальности ДНК, а о том, что одинаковых молекул в обычной пробе тысячи, ну пусть десятки тысяч (столько же, сколько взято клеток). Сколько это в молях — 10^-18...1О^-20? При таких цифрах слово «концентрация» почти теряет смысл, «Штучная» химия ДНК должна преобразиться благодаря ПЦР. О новых ее возможностях мы еще расскажем.

Принцип этого замечательного метода придумал за рулем автомобиля на ночной дороге американский биохимик Муллис по пути на свою виллу. Рядом дремала очаровательная коллега. Нам бы такие дороги!..

Впрочем, дорога из Москвы в Пущино — Симферопольское шоссе — тоже ничего. Именно по ней, возвращаясь из Франции, привез Владимир Баранов, сотрудник Института белка АН СССР, оттиск первого коротенького сообщения о полимеразной цепной реакции.

В этом известном всему миру институте под руководством академика А. С. Спирина разрабатывали систему бесклеточного синтеза белка. Это отдельная история, которую мы обязательно расскажем читателям нашего журнала. А пока для нас важно, что для бесклеточного синтеза нужны отдельные гены, с которых будет считываться информация о белке. И чем больше будет концентрация такой ДНК, тем эффективнее синтез.

Раньше гены клонировали (размножали) очень неудобным способом. Нужный участок ДНК вырезали ферментами-рестриктазами. С помощью фагов или вирусов встраивали его в хромосому-плазмиду бактерии, например кишечной палочки. Размножали эту бактерию, а вместе с ней и ген. Потом вырезали его снова и чистили.

Представьте себе, что вам нужна тысяча транзисторов. Вы делаете тысячу телевизоров и выковыриваете искомое. Похоже, не правда ли? ПЦР дает возможность делать транзисторы отдельно.

Ухабы и объезды

Владимир Баранов привез в институт еще не метод, а только указание, в какую сторону идти. Дело в том, что дорога ПЦР не такая гладкая, как написано выше. Пройдемся по ней сначала.

Ферменты, расплетающие ДНК, не годятся для ПЦР. Секвеназа, например, расплетает спираль прямо перед собой, а сзади она тут же схлопывается. Праймер не успевает найти свое место и занять его. Цепи надо развести надолго, иначе их не удастся скопировать. Тут придется в первый раз свернуть с того пути, по которому пошла природа.

Связи между комплементарными нуклеотидами не так прочны, как ковалентные. Их можно порвать тепловой энергией при температуре около 90°С. ДНК попросту плавится, распадаясь на две цепочки, доступные для праймеров и полимеразы. Доступны-то они доступны, но при такой температуре и олигонуклеотиды не свяжутся (природа связи ведь та же, что в ДНК), да и полимераза в почти кипящей воде очень быстро сварится, что по-научному называется денатурацией. Поэтому препарат надо быстро охладить градусов до шестидесяти. Затравки-олигонуклеотиды подвижнее цепей ДНК, они раньше свяжутся с цепями, чем те друг с другом, и полимераза начнет работать. Вместо старой цепи она достроит участок новой. Его тоже надо «отплавить», значит — снова резкий нагрев (полимераза варится, надо побыстрее), потом — опять охлаждение. Такую баню обычная полимераза выдерживает всего несколько раз.

Между прочим, в горячей воде живут, размножаются, а значит, синтезируют ДНК некоторые микроорганизмы — термофилы. Ясно, что они не держат свою полимеразу в холодильнике, она у них тоже термофильная. Поэтому В. Баранов и его коллеги из Института белка быстро перепробовали несколько штаммов теплолюбивых микробов и нашли полимеразы, готовые работать в пекле ПЦР. Они выдерживают больше 20— 30 температурных кочек и ухабов — вполне достаточно, чтобы накопить миллионы копий нужного гена.

Исследователи, катающиеся по хорошим дорогам, тоже соображают, тем более, условия у них для этого есть. Термофильную полимеразу из штамма Thermus aquaticus они применили еще раньше и даже запатентовали, благо там это делается быстро и, главное, надежно. Но сотрудники Института белка, не ожидавшие больше подсказок, шли своей дорогой, и нашли другой штамм, не тот что запатентован на Западе — Thermus thermophilus. Поэтому дорога на рынок — и внутренний, и внешний — была открыта для их препарата. Но об этом потом.

Еще одно препятствие на пути к ПЦР — резкая смена температур в ходе одного цикла. За доли минуты надо прыгать с 90° до 60°С и обратно. Хоть объем пробы и невелик, задача все же непростая. Сначала это делали кустарным способом: переключали потоки от двух термостатов обычным краником. И в общем, система работала, хоть и не очень удобно и быстро. А ускорилось дело, когда по совету знающих людей применили термостат на основе эффекта Пельтье (охлаждение и нагревание контактов проводников или полупроводников в зависимости от направления тока). Электроникой удобно управлять, такая термостатирующая ячейка — уже основа для прибора, который можно запрограммировать на любой профиль температур и который будет автоматически повторять циклы столько раз, сколько нужно.

Такой прибор, называемый амплификатором (amplification — англ.— умножение, усиление; другое название ПЦР — амплификация генов), разработало и выпускает сейчас предприятие «Биолюкс» в Пущине.

На подъездах к рынку, или дорога к Пущину-на-Оке

Мы добрались до точки слияния двух дорог — науки и предпринимательства, отсюда, для ПЦР в нашей стране должна бы начаться широкая магистраль.

Пущино-на-Оке, где расположен Биологический центр АН СССР,— типичный академгородок с типичными проблемами. Он вобрал в себя в середине — конце шестидесятых годов мощную команду молодых, активных, увлеченных людей. Тогда в основном и сформировалась структура институтов. Молодые завлабы той поры в большинстве своем были завлабами и в восьмидесятых. Это, наверное, нормально. Не нормально только, что те, кто пришел позже, почти не имели шансов возглавить свое дело. Обычная ситуация для малых научных городков — институтская пирамида жестка и почти не обновляется, а уйти некуда.

И вот тогда, в начале восьмидесятых, головастые мэнээсы без перспективы в обозримом будущем стать завлабами начали понимать, что на старые структуры надежды нет. Они создали «Полином», организацию по образу и подобию новосибирского «Факела», ставшую одной из первых структур НТТМ. Сначала использовали для пробивания бюрократических заслонов райком и ЦК комсомола (дело, напомню, начиналось еще в застойные годы), но, в конце концов, тесно стало и в этих рамках. Сейчас в Пущине работает самостоятельная фирма «Ока», имеющая уже и дочерние предприятия. Она выпускает реактивы и приборы для научных исследований, она проводит научные школы и конференции, даже международные. А главное, она дает опору — и материальную, и моральную — людям, которым академические структуры не могут выделить достойного места в силу своей бедности и окостенелости. При этом люди высокой учености зарабатывают не в сфере обслуживания или кролиководстве (бывает и так), а в науке. И питают эту науку, академические свои институты, высококлассной продукцией, которую иначе как на валюту не купить бы. А значит, не купить вообще.

«Ока» стала выпускать пущинскую термофильную полимеразу. По свидетельству людей, опробовавших ее в разных институтах и диагностических центрах, она лучше других. А стоит дешевле импортной примерно во столько же раз, во сколько рубль дешевле доллара.

Для сотрудников Института белка, участвующих в производстве, задача поначалу виделась так: выйти со своим оригинальным продуктом на мировой рынок и за счет этого обеспечить институт другими реактивами, без импорта которых, к сожалению, современная молекулярная биология развиваться не может. Но сначала в стране запретили бартер, потом ввели удушающие поборы на валюту, и ориентация на зарубежных потребителей почти потеряла смысл. Сейчас «Ока» продает наборы для ПЦР в основном внутри страны.

«Ока» же взялась за разработку и производство амплификаторов. Владимир Баранов рассказывает, что это была четвертая или пятая организация, куда он обратился. До этого отказывали все: и гражданское биологическое приборостроение, и богатенькие хорошей элементной базой военные. В «Оке» попросили месяц на раздумье, а через три недели все было решено. Еще через три месяца первый прибор стоял в лаборатории. «Ока» нашла и надежные элементы Пельтье, выдерживающие бешеную пляску температуры в амплификаторах, и надежных людей. Нашли и подрядчиков для серийного выпуска прибора. После тяжелых раздумий за него взялись нелегко конвертируемые военные.

2. Прибор-амплификатор, бросающий то а жар, то в холод пробирки с ДНК полимеразой и другими компонентами ПЦР

(Один из первых вопросов их был таков: при падении с какой высоты прибор должен сохранять работоспособность? Есть такой обязательный пункт в техусловиях. Ответили, что высота стола около метра. Первый макет напоминал настольный броневик.)

Так или иначе, приборы пошли в серию (рис. 2). Сейчас их продает упомянутый выше «Биолюкс», отпрыск «Оки». Из желающих уже составилась небольшая очередь. Зеленый свет, конечно, своим, пущинским, проекту «Геном человека» и, само собой, медикам. Вот только они, признав, что пущинский прибор лучше не только других отечественных, но и импортных, не поспешают.

Окольные пути ПЦР-диагностики

Распознать вирус, пока он еще не натворил бед, пока его так мало, что по результатам других методов — просто нет, вот что может ПЦР. Этот метод в десятки и сотни тысяч раз чувствительнее лучших иммуноферментных методов. Онкогенные вирусы, ВИЧ, подолгу ждущие своего часа, укрывшись в геноме человека, можно поймать в микроскопической биопробе, капельке крови, одном волосе. Вирус гепатита с помощью амплификации можно обнаруживать в воде и предупреждать заражение. Можно. И уже были бы, наверное, работающие диагностикумы, если бы взяться вовремя.

Баранов и его коллеги с 1987 года тормошат медиков. Один из первых своих приборов отдали в диагностический центр — давайте, ребята! А что же медики? Вот один из ответов: денег под это нет, даже если удастся разработать диагностику за счет других тем, поднимут план, а денег опять не дадут, как тогда крутиться? Пытались биологи сами что-то сделать, но как работать с патогенными вирусами в неприспособленном для этого институте? ПЦР, мощнейший диагностический метод, въезжал в медицину, как и многое другое, окольными путями.

Только осенью 1989 года Минздрав СССР принял наконец постановление о развитии молекулярной диагностики, выделены деньги, открыт специальный центр. Хоть и поздновато, но все равно хорошо. И не надо начинать с нуля — есть уже и производственная база, и готовые помочь люди, прокладывавшие дорогу ПЦР, в том числе и в медицину. Они показали, что умеют не копировать западные разработки, а идти своим путем.

Вернемся к преступникам, о которых шла речь в начале статьи. ПЦР наверняка будут широко использовать в судебно-медицинской экспертизе. С помощью этого метода легко идентифицировать человека по микрокапельке крови или другой биологической жидкости, по кусочку волоса или кожи; можно надежно устанавливать отцовство. Так что, может быть, когда-нибудь среди паспортных данных появятся и специфические для каждого человека последовательности нуклеотидов в ДНК.