Лекарственный фон планеты

История с пиявками

Укус — это всегда неприятно, особенно если в рану попадет инфекция. А такое случается даже при укусе медицинской пиявки, и гирудотерапевты прекрасно об этом знают. По мнению отечественных специалистов, ранка воспаляется при неправильном уходе, если ее расчесывают или заносят грязь. В западных клиниках источником инфекции считают бактерии, населяющие кишечник медицинской пиявки. Симбионтов у нее мало, один из них принадлежит к роду Aeromonas, включающему и патогенные для человека виды. Для профилактики заражения пациентам дают антибиотики, в том числе ципрофлоксацин (Цп).

Все шло хорошо до 2011 года, когда из косметологических клиник США, Канады и Франции стали поступать сообщения о штаммах Aeromonas, устойчивых к антибиотику. Медицинских пиявок используют в пластической хирургии, чтобы улучшить кровоснабжение пересаженных кожно-мышечных лоскутов, и семь пациентов пострадали после гирудотерапии, несмотря на антибиотики, — им в ранки попала инфекция.

Эти случаи, крайне неприятные сами по себе, озадачили специалистов, которые не могли понять, где бактерии могли обрести устойчивость к ципрофлоксацину? Времена дуремаров прошли, пиявок больше не вылавливают в прудах, а разводят на специальных фермах, в контролируемых условиях, и антибиотиков им не дают. С фермы пиявки поступают в клинику, там дожидаются своей очереди в аквариумах с чистой водой. Используют их только один раз. Кишечным Aeromonas просто негде контактировать с Цп, и антибиотик должен был их убить. Проблемой заинтересовалась группа исследователей под руководством профессора Коннектикутского университета Йорга Графа, специалиста по микрофлоре пиявочного кишечника («mBio»).

Научной общественности они сообщили две новости: плохую и хорошую. Хорошая заключается в том, что пиявки ни при чем, их кишечные симбионты не виноваты в заражении пациентов. Анализ ДНК 32 клонов бактерий, взятых из кишечника и с мест укуса, показал, что в пиявках обитают преимущественно Aeromonas veronii, а в ранках размножается другой вид, A. hydrophila, который в кишечнике приживается плохо, потому что предпочитает водную среду, а не кровь. Два вида Aeromonas очень похожи, биохимическими методами, которые использовали клиницисты, их различить нельзя, потому и возникло недоразумение. Источником инфекции, скорее всего, стали аквариумы, где держат пиявок. A. hydrophila размножились там, налипли на покровы червей и попали в организм пациентов как внутрибольничная инфекция.

А теперь плохая новость, даже две. Оба вида аэромонад оказались устойчивы к Цп, и этот препарат в следовых количествах обнаружили в пищеварительном тракте пиявок. А это значит, что мир загрязнен антибиотиками сильнее, чем мы думали, и резистентность к ним может развиваться даже при очень низкой концентрации.

В кишечнике пиявок, помимо ципро-флоксацина, нашли его ветеринарный аналог энрофлоксацин. Фермеры кормят пиявок кровью домашней птицы (кровь крупного рогатого скота не используют после вспышки коровьего бешенства), а курам для профилактики заболеваний и лучшего роста дают антибиотики. Из их крови препараты попадают в кишечник пиявок.

Есть такой показатель — минимальная ингибирующая концентрация (МИК). Это минимальная концентрация антибиотика, при которой бактерии полностью прекращают рост. Для аэромонад МИК ципрофлоксацина и энрофлоксацина равна 4 микрограммам на миллилитр (мкг/мл); концентрация антибиотиков в кишечнике пиявок варьировала от 0,01 до 0,04 мкг/мл, то есть на два порядка меньше МИК.

Ципрофлоксацин подавляет активность бактериального фермента ДНК-гиразы, необходимой для нормального синтеза ДНК, роста и деления бактерий. Устойчивость к антибиотику вызывают мутации в гене ДНК-гиразы gyrA, и такие мутации профессор Граф и его сотрудники обнаружили в геномах обоих видов Aeromonas, причем 80% мутантов приходится на долю кишечных симбионтов A. veronii.

Поскольку мутация gyrA мешает работе жизненно важного фермента, в обычных условиях устойчивые штаммы должны размножаться очень плохо и только в присутствии антибиотика получать селективное преимущество. При концентрациях меньше МИК будут преобладать чувствительные бактерии.

И действительно, в чашках с питательной средой без антибиотика или при концентрациях Цп 0,0025 или 0,007 мкг/мл устойчивые штаммы А. hydrophila растут в 100 тысяч раз медленнее чувствительных, а мутанты A. veronii — в 100—1000 раз медленнее. Однако уже при концентрации всего 0,01 мкг/мл мутанты получают преимущество над обычными штаммами, превосходя по численности обычных бактерий в миллион раз. Сходная картина наблюдается и в естественных условиях: даже следовые концентрации антибиотика в пищеварительном тракте пиявок благоприятствуют росту устойчивых к Цп мутантов. Так не должно быть, но это так!

Устойчивые штаммы A. veronii появились несколько лет назад и уверенно теснят чувствительных. Мутанты не идентичны, но очень похожи, и условия содержания пиявок позволяют бактериям поддерживать устойчивость.

Полет антибиотиков

История с пиявками показывает, что даже фоновые концентрации антибиотика могут быть опасны. А ведь они везде, ими загрязнены почва, вода и воздух. Во внешнюю среду антибиотики попадают разными путями. Вот, например, фторохинолоны, к которым относятся ципрофлоксацин и энро-флоксацин. Значительная их часть не метаболизируется в организме и выходит наружу в неизменном виде. Они попадают в канализацию, сточные воды фармацевтических фабрик и больниц. Концентрация фторхинолонов в реках достигает 0,0059 мкг/мл; в больничных сточных водах — 0,021 мкг/мл, а согласно другим данным, аж 6 мкг/мл; в стоках фармацевтических предприятий уровень Цп колеблется от 28 до 31 мкг/мл. Вот где отличный отбор на устойчивость!

И все-таки основной источник лекарственного загрязнения — сельское хозяйство. Около 70% всех антибиотиков применяют именно там. Их используют не только как лекарство и профилактическое средство, но и в качестве кормовых добавок, чтобы животные росли быстрее. Антибиотики добавляют в аквакультуры. В результате устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий становится все больше. Недавно резистентность обрели кампилобактерии, возбудители диареи. Они заражали мясо цыплят, которых пичкали фторохинолонами, и приобрели к нему устойчивость.

Концентрация фторохинолонов в сточных водах животноводческих ферм достигает 0,0075 мкг/мл; в навозе — 19 мкг/г. Не следует забывать и про пыль. Это обычное явление в засушливых скотоводческих районах. Недавно специалисты Техасского технологического университета поинтересовались составом пыли, которую ветер поднимает на откормочных площадках («Environmental Health Perspectives»). Это место, где животные под открытым небом не пасутся, а едят из кормушек (рис. 1). На частицах пыли, летящей с десяти площадок, исследователи обнаружили пять антибиотиков, концентрация которых варьировала от 0,5 до 4,6 мкг на грамм пыли. В большинстве проб присутствуют тетрациклиновые антибиотики — тетрациклин, хлотетрациклин и окситетрациклин; иногда встречаются монензин и тилозин — это антибиотики и ускоряющие рост кормовые добавки.

1. Современные откормочные площадки рассчитаны на тысячи животных, и каждое поднимает до 100 г пыли в день

На пылевые частицы налипли и бактерии, в том числе патогенные для человека: коринебактерии (возбудители дифтерии), лептоспиры, клостридии, бактероиды и стафилококки. Выделив из этого сообщества ДНК, исследователи идентифицировали шесть последовательностей, которые обеспечивают устойчивость бактерий к тетрациклину, частота встречаемости этих генов не зависит от концентрации антибиотиков.

Мельчайшие частицы пыли диаметром несколько микрометров улетают примерно на 3,5 км. Судьба перенесенных ими антибиотиков различна. Тетрациклин сохраняется в почве от 30 до 180 дней, в воде — 15—30 дней. Монензин остается активным более 70 дней, тилозин деградирует всего за 30.

Известны случаи, когда пыль переносила микроорганизмы на огромные расстояния («EcoHealth»). Длительные наблюдения за вспышками бактериального менингита в Бенине (Западная Африка) показали, что они связаны с пыльными бурями в Сахаре. Случаи межконтинентального переноса патогенов пока не описаны, но пыль однажды перелетела из Африки во Флориду, а между ними более 6,5 тысячи км (рис. 2). Пыль из Мали достигала Карибских островов.

2. Пыльная буря над западным побережьем Африки, 2 марта 2003 года

Большая устойчивость при слабом отборе

Непросто найти на планете место, свободное от антибиотиков, и, хотя их концентрация существенно меньше МИК, этого вполне достаточно для появления бактерий, обладающих сильной устойчивостью. Причем механизмы возникновения устойчивости при низких и высоких концентрациях различаются.

Когда бактерии оказываются в среде с концентрацией антибиотиков выше МИК (больной начал принимать лекарства), они погибают. Выжить могут лишь те, у которых уже была мутация устойчивости. При концентрациях в несколько десятков или сотен раз ниже МИК ситуация иная. Бактерии в таких условиях продолжают расти, потому что антибиотик их не убивает, но при этом постепенно накапливают мутации устойчивости. Причем происходят эти мутации преимущественно в генах, которые раньше не считались типичными генами резистентности.

Специалисты Упсальского университета изучили последствия длительного пребывания кишечной сальмонеллы Salmonella enterica при низкой концентрации стрептомицина («Nature Communications»).

Шведские ученые заставили 20 линий сальмонеллы прожить 900 поколений при концентрации стрептомицина 1 мкг/мл, в четыре раза меньшей, чем МИК. Такая низкая концентрация не убила бактерий, а лишь немного замедлила их рост. В результате отбора исследователи получили набор устойчивых к стрептомицину клонов, у которых МИК варьировала от 64 до 1024 мг/л, в зависимости от количества приобретенных мутаций. Полный набор включал пять штук.

Стрептомицин проходит через микробную стенку и связывается со специфическими белками рибосомы, нарушая синтез белка. Одна из мутаций, приобретенных сальмонеллами, уменьшала связывание стрептомицина с рибосомой. Еще три мешали клетке поглощать аминогликозиды, а стрептомицин как раз аминогликозид. Пятая мутация активировала фермент, который модифицирует аминогликозиды. Каждая мутация обеспечивает слабую устойчивость к стрептомицину, однако их комбинация позволяет спокойно переносить высокие дозы. Чтобы накопить эти мутации, требуется время, но у бактерий оно есть, потому что при низких концентрациях антибиотика им ничто не угрожает. Мутации происходят в генах, которые ранее не считали ответственными за резистентность.

Отбор устойчивых клонов при концентрации выше МИК всегда приводил к появлению лишь одной мутации rpsL, которая препятствует связыванию с рибосомой. При низкой концентрации антибиотика такая мутация не возникла ни разу. Если бы устойчивость к антибиотикам определяли, отыскивая в геноме бактерий известные мутации резистентности к стрептомицину, штаммы сальмонелл из Упсалы сочли бы чувствительными.

Мутации расползаются

Раз возникнув, резистентность к антибиотикам распространяется в микробном сообществе.

У пиявочных бактерий Aeromonas, помимо хромосомной мутации gyrA, есть и другие, они затрагивают репликацию ДНК и способствуют устойчивости к Цп. Некоторые из этих генов находятся на плазмидах — небольших кольцевых молекулах ДНК, существующих отдельно от хромосомы. Бактерии, даже принадлежащие к разным видам, легко обмениваются плазмидами, поэтому гены устойчивости могут попадать из кишечных аэромонад в больничные и наоборот.

Естественно, устойчивость к антибиотикам приобретают не только патогены, но и симбиотические бактерии кишечника и кожи, поскольку вынужденно соприкасаются с антибиотиками. Так, в больнице бактерии кишечной микрофлоры быстро становятся устойчивыми к фторохинолонам, а затем передают гены резистентности патогенам.

Еще один пример — безвредная бактерия Macrococcus caseolyticus, которая живет у коров на коже. В процессе доения она может попасть в молоко и продукты, изготовляемые из сырого молока, в том числе в сыр. Специалисты Института ветеринарной бактериологии Бернского университета обнаружили, что M. caseolyticus из молока коров, страдавших маститом, необычайно устойчивы к антибиотикам класса бета-лактамов: пенициллину, цефалоспорину и метициллину, которыми лечат больных животных («Scientific Reports»). Причем ген устойчивости у них новый, доселе неизвестный. Его назвали mecD.

Макрококки — близкие родичи стафилококков, а цефалоспорин — единственный антибиотик, который побеждает устойчивый к метициллину золотистый стафилококк. Участок хромосомы, содержащей mecD, может спонтанно вырезаться, образуя кольцевую молекулу, и встраиваться в хромосому золотистого стафилококка, благо оба вида обитают по соседству. M. caseolyticus с новым геном устойчивости обнаружили на коже собаки, следовательно, бактерия может колонизировать разные виды животных. У человеческих бактерий ген mecD пока, по счастью, не встречали.

Путешествия генов резистентности между разными видами бактерий для людей опасны, даже если речь идет о ветеринарных антибиотиках, которые не используют в здравоохранении. Получив такую мутацию, человеческие патогены могут приобрести множественную лекарственную устойчивость.

До недавнего времени специалисты смотрели на проблему лекарственной устойчивости с умеренным оптимизмом. За любое полезное приобретение, полагали они, приходится платить. Мутации устойчивости к антибиотикам затрагивают жизненно важные гены. У резистентных микроорганизмов нарушены репликация ДНК, белковый синтез, транспорт продуктов метаболизма, что существенно снижает их жизнеспособность и вирулентность в чистой среде. При аккуратном использовании антибиотиков обычные штаммы будут вытеснять устойчивые, и резистентность можно будет если не победить, то загнать в определенные рамки. Увы, при ближайшем рассмотрении перспектива оказалась не такой радужной.

Вместо чистой среды приходится иметь дело с очень малыми концентрациями антибиотиков. Бактерии в таких условиях приобретают устойчивость к лекарствам и при этом прекрасно себя чувствуют.

Даже обладатели традиционных мутаций устойчивости, затрагивающих жизненно важные функции, порой не уступают в приспособленности и вирулентности своим чувствительным собратьям, а то и превосходят их («Bioessays»). В их числе оказались возбудитель больничной инфекции синегнойная палочка Pseudomonas aeruginosa; еще один больничный патоген Acinetobacter baumannii, вызывающий инфекции кровотока, менингит и пневмонию, раневые и урологические инфекции; холерный вибрион Vibrio cholerae. Некоторые штаммы устойчивых к антибиотикам возбудителей туберкулеза и брюшного тифа оказываются более вирулентными, чем чувствительные бактерии.

Анализ ДНК показал, что мутации устойчивости, влияющие на жизнеспособность, компенсируются другими мутациями. Например, снижение активности ДНК-гиразы можно нейтрализовать повышенной активностью топоизомеразы. Такие двойные мутанты имеют повышенную приспособленность. Сальмонеллы, устойчивые к стрептомицину, быстрее дикого типа растут при недостатке углеводов. Золотистый стафилококк, устойчивый к рифампицину, в организме быстрее образует биопленки.

Как бороться с инфекциями, которые невосприимчивы ко многим антибиотикам и прекрасно себя чувствуют при их отсутствии? Идея использовать антибиотики как можно реже себя не оправдывает. Медики предлагают чередовать несколько антибиотиков, сходных по структуре и сайту действия. Они надеются, что такая стратегия затруднит бактериям выработку резистентности.

Можно использовать иммунотерапию, например антитела к поли-бета-1,6-N-ацетил-глюкозамину. Это полисахарид, необходимый многим бактериям для образования биопленок. Антитела к этому полисахариду могут уничтожить бактерии с множественной лекарственной устойчивостью.

Еще один вариант — фототерапия. Специалисты университета Цинциннати попытались таким образом уничтожить устойчивый к метициллину золотистый стафилококк. Они запатентовали гель, в состав которого входят наночастицы, покрытые фотосенсибилизатором. Под действием света он окисляется, образуя активные формы кислорода, уничтожающие бактерии. Предварительные испытания показали, что препарат очищает раны от инфекции и ускоряет их заживление, не повреждая при этом клетки кожи.

Эти и другие технологии пока испытывают на животных. А нам в ожидании результатов остается мыть руки, соблюдать гигиенические нормы и не злоупотреблять антибиотиками.

Кандидат биологических наук
Н.Л. Резник